李曉霞

（濱州市中心醫(yī)院結(jié)核科 山東 濱州 251700）

結(jié)核病是目前重點(diǎn)控制的傳染疾病之一，是全球需要面對(duì)的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題。結(jié)核分枝桿菌（mycobac teriumtu berculosis, MTB）是引起肺結(jié)核主要致病菌，MTB 細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較為特殊，具有較強(qiáng)的耐藥性，能抵抗多種藥物，疾病治療時(shí)間長(zhǎng)，易增加患者的治療負(fù)擔(dān)；且該病若未能得到有效診治，會(huì)侵犯機(jī)體全身器官，嚴(yán)重危害患者的身體健康以及生命安全[1-2]。因此需要加強(qiáng)對(duì)結(jié)核病的積極防治，一旦發(fā)現(xiàn)該疾病，盡早隔離并接受針對(duì)性治療能夠幫助患者遠(yuǎn)離疾病痛苦。當(dāng)前，痰培養(yǎng)、涂片法、分子生物學(xué)等檢測(cè)方法原理各不相同，其檢查結(jié)果也存在一定差異性[3-4]。細(xì)菌學(xué)檢查是發(fā)現(xiàn)傳染源的主要途徑和手段，其中涂片法與痰培養(yǎng)是既往常用的檢測(cè)方式，能夠發(fā)現(xiàn)病原菌活動(dòng)特點(diǎn)，且操作簡(jiǎn)單、易行，但培養(yǎng)耗時(shí)較長(zhǎng)，且影響因素較多，再加上部分患者癥狀并不具有典型性特點(diǎn)，影像學(xué)表現(xiàn)特征不足，因此部分患者難以獲得早期確診，甚至還會(huì)有誤診、漏診情況發(fā)生，影響患者后續(xù)治療[5-6]。聚合酶聯(lián)反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR）技術(shù)的應(yīng)用為MTB 細(xì)菌學(xué)檢查提供了特異、敏感、簡(jiǎn)單的檢查方法，能夠檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌脫氧核糖核酸，有利于疾病進(jìn)一步確診[7]。本文旨在對(duì)比涂片檢測(cè)方法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法（GeneXpert MTB/RIF）檢測(cè)MTB 和對(duì)結(jié)核的診斷效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取2021 年1 月—12 月濱州市中心醫(yī)院結(jié)核科三病區(qū)住院肺結(jié)核患者144 例，非結(jié)核患者41 例。結(jié)核患者中，男性106 例，女性38 例；年齡14 ～82 歲，平均年齡（53.26±10.32）歲。非結(jié)核患者中，男性31 例，女性10 例；年齡16 ～78 歲，平均年齡（51.67±9.06）歲；疾病類(lèi)型：肺炎26 例，肺癌2 例，結(jié)節(jié)病4 例，哮喘3 例，肺泡蛋白沉積癥1 例，間質(zhì)性肺病1 例，非結(jié)核分枝桿菌病1 例，支氣管擴(kuò)張并感染3 例。符合《赫爾辛基宣言》要求。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①肺結(jié)核患者應(yīng)符合《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》（WS-288-2008），且存在咳嗽、咯血、盜汗等一系列表現(xiàn)癥狀；非結(jié)核患者不符結(jié)核診斷校準(zhǔn)且不存在上述癥狀。②入院后完善個(gè)人信息電子檔案建立，病史資料完整；③患者無(wú)嚴(yán)重心腦血管疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①病史資料不全者；②不配合檢測(cè)者。

1.2 方法

所有患者均在早中晚漱口后，在醫(yī)護(hù)人員指導(dǎo)下深咳，并將痰液裝入一次性痰液杯中，加蓋送檢。（1）涂片檢測(cè)法：用竹簽蘸取少量膿樣痰液標(biāo)本，將其涂抹于載玻片右側(cè)中央位置，于自然環(huán)境中晾干，并進(jìn)行加熱固定，行抗酸染色鏡檢。將石碳酸復(fù)紅染色液滴于載玻片上，蓋滿玻片后用微火固定，觀察到有蒸汽出現(xiàn)后停止，保持5 min，用蒸餾水進(jìn)行水洗；用酸性酒精脫色1 min，流水自玻片一端輕緩沖洗，如脫色不徹底，可重復(fù)一次；滴加亞甲藍(lán)復(fù)染液，染色30 s，瀝去復(fù)染液，沖洗玻片，瀝水，將染色后的玻片置于玻片架上，自然晾干；滴加鏡油鏡檢觀察。（2）實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)：取2 ～4 mL 標(biāo)本，加入2 ～3 倍樣本體積的消化液溶液液化振蕩20 次左右，靜置液化30 min 后，取2 mL樣本置入PCR 反應(yīng)管，放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀器（美國(guó)Cepheid 公司生產(chǎn)）進(jìn)入檢測(cè)，約2 h 后查看結(jié)果。

1.3 陽(yáng)性結(jié)果判定及觀察指標(biāo)

（1）檢驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果判定：涂片檢驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果判定：以顯微鏡下100 個(gè)視野中發(fā)現(xiàn)≥3 條抗酸桿菌為陽(yáng)性，未觀察到或＜3 條抗酸桿菌為陰性；實(shí)時(shí)熒光定量PCR法陽(yáng)性結(jié)果判定：以檢測(cè)值≥500 copies/mL 為陽(yáng)性。（2）觀察指標(biāo)：觀察兩種檢測(cè)方式的MTB 陽(yáng)性率和診斷的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用（± s）表示，行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)（n）和百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 痰涂片檢查與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢查MTB 陽(yáng)性率比較

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法MTB 陽(yáng)性率高于涂片檢測(cè)法，兩種檢測(cè)方法陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩種檢測(cè)方法MTB 陽(yáng)性率比較

2.2 兩種檢測(cè)方法診斷結(jié)果，見(jiàn)表2

表2 兩種檢測(cè)方法診斷結(jié)果（例）

2.3 觀察兩種檢測(cè)方式的診斷效果比較

兩種檢測(cè)方式診斷效果相比，以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)施熒光定量PCR 法檢測(cè)診斷的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度及陰性預(yù)測(cè)值均高于涂片法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩種檢測(cè)方法診斷陽(yáng)性預(yù)測(cè)值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見(jiàn)表3。

表3 兩種檢測(cè)方法診斷的效果比較（%）

3.討論

結(jié)核病是由MTB 引起的慢性傳染性疾病，其隨著生活環(huán)境改變、不合理用藥、不良生活方式等因素影響，發(fā)病率逐漸呈上升趨勢(shì)，給大眾身體健康以及社會(huì)安全帶來(lái)了許多負(fù)面影響，為此加強(qiáng)對(duì)該疾病的有效防治是控制疾病進(jìn)一步傳播的關(guān)鍵[8]。病原學(xué)檢測(cè)方式是診斷結(jié)核病的重要方法之一，其中涂片法與培養(yǎng)法臨床應(yīng)用較為廣泛，培養(yǎng)法具有較高的診斷確診率，通過(guò)專(zhuān)用培養(yǎng)器皿來(lái)觀察致病菌，但其培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，易受環(huán)境、溫度等因素影響，存在假陽(yáng)性和假陰性情況；涂片法是結(jié)核分枝桿菌檢查中最常用的檢測(cè)手段，其簡(jiǎn)單易行，對(duì)檢測(cè)人員檢驗(yàn)操作水平要求不高，但痰液標(biāo)本中不僅包含MTB，還包括其他非結(jié)核桿菌，其也會(huì)使抗酸染色，形成假陽(yáng)性，且部分患者也有結(jié)核桿菌染色不明顯而漏診，檢測(cè)準(zhǔn)確性未能得到有效保障，需要尋求另外一種檢測(cè)方法[9]。隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)也取得了進(jìn)一步的發(fā)展，新技術(shù)的應(yīng)用提高了結(jié)核病的診斷效率，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法。

本文結(jié)果顯示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法陽(yáng)性率（60.00%）高于涂片檢測(cè)法（42.16%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組檢測(cè)方式診斷效果相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)診斷的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度及陰性預(yù)測(cè)值均高于涂片法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。充分肯定該檢測(cè)方法的診斷效果。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法通過(guò)檢測(cè)結(jié)核桿菌DNA 來(lái)判斷患者是否有MTB 感染情況，進(jìn)而判斷患者是否患有結(jié)核病，其能提升MTB 早期檢出率的可能。實(shí)時(shí)熒光PCR 法是將熒光反應(yīng)物加入PCR 反應(yīng)體系中，通過(guò)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的累積，實(shí)現(xiàn)監(jiān)測(cè)PCR 的進(jìn)程，且還有助于擴(kuò)張反應(yīng)體系中熒光強(qiáng)度為依據(jù)定量分析特定DNA，能避免檢出過(guò)程中受污染、環(huán)境等因素影響，能提升檢測(cè)速度及敏感性，能減少假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)[10]。該檢測(cè)方法能夠早期診斷MTB 菌血癥，防止繼發(fā)性MTB 病灶形成，且該檢測(cè)方法僅需2 ～4 h 便能夠有效檢測(cè)某些培養(yǎng)法難以實(shí)施病例，提高檢測(cè)敏感性。此外，該檢查方法可以擴(kuò)張著色活菌，以此來(lái)判斷病灶良惡性。與普通PCR 方法相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法敏感度更高，由自動(dòng)化儀器收集熒光信號(hào)，避免了檢驗(yàn)人員肉眼判斷的主觀性，能提高檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性；且全封閉反應(yīng)，無(wú)需PCR 后處理，保證了檢驗(yàn)結(jié)果的可靠與可重復(fù)性；另外在線實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光，檢驗(yàn)結(jié)果客觀且直觀，無(wú)需接觸有毒試劑，操作安全，省時(shí)高效；因此該檢測(cè)方式適應(yīng)范圍更廣，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。既往研究表明，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法對(duì)MTB 耐藥性有一定的檢測(cè)價(jià)值，能夠?yàn)榕R床合理用藥提供指導(dǎo)[11]。另有研究表明，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法能夠有效分析和觀察MTB 感染發(fā)生通路，能夠幫助臨床進(jìn)一步認(rèn)識(shí)疾病發(fā)病機(jī)制，從而為后續(xù)診治提供更多可能性[12]。提示應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法具有較好的應(yīng)用前景，可見(jiàn)該檢查方法在結(jié)核疾病診治中發(fā)揮著重要作用。

值得注意的是，檢驗(yàn)過(guò)程中可能會(huì)因個(gè)體免疫差異較大，取材標(biāo)本中Taq 酶抑制劑因子含量高影響PCR 擴(kuò)增進(jìn)程，進(jìn)而導(dǎo)致假陰性結(jié)果出現(xiàn)，且還會(huì)受患者用藥影響。為進(jìn)一步提高對(duì)病情的判斷，可綜合其他檢查結(jié)果來(lái)進(jìn)行評(píng)估，以提高準(zhǔn)確率，幫助患者盡快接受診治。

綜上所述，結(jié)核病對(duì)人體安全和社會(huì)安全影響大，需要加強(qiáng)防治，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢驗(yàn)方式，能夠提高M(jìn)TB 診斷準(zhǔn)確率，能夠?yàn)榛颊吆罄m(xù)治療提供有利的診斷依據(jù)，臨床可應(yīng)用。