郭麗蘋，蘇 娟（通信作者），胡亞榮，陳名陽

（大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 云南 大理 671000）

肝缺血-再灌注損傷（hepatic ischemia-reperfusion injury, HIRI）是指肝臟因手術(shù)或意外缺血一段時(shí)間，之后再恢復(fù)血供時(shí)，肝臟損傷進(jìn)一步加重的現(xiàn)象。HIRI 多發(fā)生在創(chuàng)傷性休克、阻斷血管的肝臟切除術(shù)和肝移植過程中，?？蓪?dǎo)致術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生，直接影響患者的預(yù)后。臨床上對HIRI 的治療有外科手術(shù)和藥物治療[1]。手術(shù)治療包括缺血預(yù)適應(yīng)、缺血后適應(yīng)、機(jī)器灌注。因缺血大多情況下為不可預(yù)知因素，且缺血后適應(yīng)的每一次再灌注都可能導(dǎo)致出血，限制了缺血預(yù)適應(yīng)和后適應(yīng)在臨床中的應(yīng)用；機(jī)器灌注因技術(shù)復(fù)雜性限制了其在臨床上的應(yīng)用。藥物治療方面，常用的是抗炎、抗氧化類藥物，但多因肝臟毒性不良反應(yīng)和靶點(diǎn)的單一性，降低了其對HIRI 的治療效果[2]。中藥在多種疾病治療的過程中體現(xiàn)了良好的效果及較小的不良反應(yīng)。研究表明燈盞細(xì)辛有抗炎、抗凋亡和調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激等作用[1,3]。關(guān)于燈盞細(xì)辛在腦、心肌和腎缺血再灌注損傷中的研究較多，但鮮有HIRI 相關(guān)研究。因此本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測燈盞細(xì)辛治療HIRI 的潛在機(jī)制，同時(shí)利用分子對接技術(shù)對潛在靶點(diǎn)進(jìn)行初步驗(yàn)證，以期為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1.資料與方法

1.1 藥物活性成分的鑒定和作用靶點(diǎn)的篩選

在一定條件的口服生物利用度（OB）和類藥性（DL）下，利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)篩選燈盞細(xì)辛活性成分，并整理活性成分相對應(yīng)的靶點(diǎn)信息，再采用Uniprot 數(shù)據(jù)庫將靶點(diǎn)信息標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 藥物對抗疾病的靶點(diǎn)預(yù)測

以“hepatic ischemia-reperfusion injury”為關(guān)鍵詞，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中獲得HIRI 疾病靶點(diǎn)。將1.1中的藥物靶點(diǎn)和HIRI 疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny2.1.0 在線軟件作圖工具平臺(tái)進(jìn)行交集，得到藥物與疾病的交叉靶點(diǎn)。采用Cytoscape3.7.1 軟件將以上藥物、成分及疾病、靶點(diǎn)進(jìn)行可視化。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將1.2 中得到的交叉靶點(diǎn)采用STRING 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析并構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。然后利用Cytoscape3.7.1 軟件中的cytoHubba 插件對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獲得排名前10 的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 通路富集分析

采用DAVID 數(shù)據(jù)庫，設(shè)置P≤0.05，將1.2 中獲得的交叉靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析。采用微生信在線工具將篩選整理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析，進(jìn)一步說明靶點(diǎn)和信號通路在燈盞細(xì)辛治療HIRI 的作用。

1.5 分子對接

通過GO 和KEGG 富集分析，確定燈盞細(xì)辛活性成分靶向HIRI 的潛在核心靶蛋白。分別利用RSCB PDB數(shù)據(jù)庫和中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)，獲得核心靶蛋白及活性成分的3D 結(jié)構(gòu)。將兩者的3D 結(jié)構(gòu)導(dǎo)入AutoDock Tools 軟件進(jìn)行脫水、加氫處理后，采用AutoDock Vina 插件進(jìn)行分子對接。最后利用Pymol 軟件實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)可視化及均方根差值的計(jì)算。當(dāng)均方根差值≤2.0 時(shí)，證明分子對接是成功的。

2.結(jié)果

2.1 燈盞細(xì)辛潛在活性成分的鑒定和作用靶點(diǎn)的篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)中輸入燈盞細(xì)辛、設(shè)置OB ≥30%、DL ≥0.18，篩選出12 個(gè)潛在活性成分（見表1）和相對應(yīng)的靶點(diǎn)。利用UniProt 數(shù)據(jù)庫對靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，將標(biāo)準(zhǔn)化的信息進(jìn)行整理后，獲得203 個(gè)藥物靶點(diǎn)。

表1 燈盞細(xì)辛潛在活性成分

2.2 藥物對抗疾病的靶點(diǎn)預(yù)測

通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫獲得1 188 個(gè)疾病靶點(diǎn)。將1 188 個(gè)疾病靶點(diǎn)和2.1 中藥物的203 個(gè)靶點(diǎn)在Venny2.1.0 在線軟件作圖工具平臺(tái)上進(jìn)行分析，并繪制韋恩圖（見圖1）。共獲得111 個(gè)交叉靶點(diǎn)，即藥物對抗疾病的潛在靶點(diǎn)。

圖1 燈盞西細(xì)辛與HIRI 靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建與分析

將2.2 中獲得的111 個(gè)交叉靶點(diǎn)與2.1 中獲得的12 個(gè)活性成分對應(yīng)的203 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行比對，并刪除不含交集靶點(diǎn)所對應(yīng)的活性成分，最終獲得9 個(gè)潛在活性成分。利用Cytoscape3.7.1 軟件繪制“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖（見圖2），并分析出9 種活性成分的度值（見表2），度值越大提示該活性成分越重要。

表2 燈盞細(xì)辛9 種活性成分的度值

圖2 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病的相互作用網(wǎng)絡(luò)

紅色三角形表示藥物，藍(lán)色菱形表示活性成分，綠色橢圓形表示共同靶點(diǎn)，黃色長方形表示疾病。

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將111 個(gè)交叉靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫中，選擇物種為人，設(shè)置置信度≥0.4，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（見圖3）。利用Cytoscape3.7.1 軟件對PPI 結(jié)果進(jìn)行分析，得到度值較大的前10 名基因TNF、AKT1、IL6、IL1B、VEGFA、TP53、PTGS2、CASP3、MMP9、HIF1A 可能是燈盞細(xì)辛治療HIRI 的潛在靶點(diǎn)。

圖3 燈盞細(xì)辛與HIRI 的111 個(gè)交叉靶點(diǎn)的PPI 圖

2.5 富集分析

采用DAVID 數(shù)據(jù)庫對交集靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析。GO 結(jié)果顯示，富集到645 條生物過程（BP），主要與基因表達(dá)的正調(diào)控、凋亡過程、炎癥反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物反饋調(diào)節(jié)過程相關(guān)；富集到56 條細(xì)胞組分（CC），主要有胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞質(zhì)、核、線粒體等；富集到111個(gè)分子功能（MF），主要與蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄激活因子活性、DNA 結(jié)合等有關(guān)。選擇BP、CC、MF 富集程度的前20 的結(jié)果用微生信在線軟件進(jìn)行柱狀圖繪制（見圖4）。KEGG 結(jié)果顯示，共富集到158 條信號通路，包括PI3K-Akt、細(xì)胞凋亡、癌癥、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化等信號通路。將排名前20 的GO 和KEGG結(jié)果用微生信在線軟件繪制成氣泡圖（見圖5）。

圖4 燈盞細(xì)辛治療HIRI 的GO 富集分析

圖5 燈盞細(xì)辛治療HIRI 的KEGG 富集分析

2.6 分子對接

運(yùn)用AutoDock Vina 1.1.2 將燈盞細(xì)辛活性成分中度值＞50 的槲皮素、山柰酚、木犀草素分別對接至TNF、AKT1、IL6、IL1B、VEGFA、TP53、PTGS2、CASP3、MMP9、HIF1A 的活性口袋，并獲得Vina 得分（見圖6）。Vina 得分越低代表靶蛋白和藥物小分子的親和力越高。利用PyMOL 軟件計(jì)算所得均方根差值均小于1，提示槲皮素、山柰酚、木犀草素與TNF、AKT1、IL6、IL1B、VEGFA、TP53、PTGS2、CASP3、MMP9、HIF1A 均有較好的結(jié)合能力。

圖6 燈盞細(xì)辛主要活性成分與PPI 網(wǎng)絡(luò)排名前10 靶蛋白的結(jié)合能熱圖

3.討論

HIRI 是肝臟手術(shù)不可避免的并發(fā)癥，直接影響患者的預(yù)后。HIRI 的發(fā)生機(jī)制尚未明確，目前認(rèn)為主要的發(fā)生機(jī)制有自由基生成增多、細(xì)胞內(nèi)鈣超載和炎癥反應(yīng)過度激活等。因HIRI 病理過程復(fù)雜性，限制了目前相關(guān)治療的效果。燈盞細(xì)辛是臨床上治療心、腦組織缺血性卒中的常用藥。目前尚無臨床上燈盞細(xì)辛治療HIRI 的數(shù)據(jù)。有研究表明[4]燈盞細(xì)辛注射液能提高SD 大鼠肝臟組織中SOD 及Bcl-2 的表達(dá)，降低MDA 及Bax 的表達(dá)，對HIRI 起保護(hù)作用，但具體機(jī)制尚不明確。

因此，本研究在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的基礎(chǔ)上，初步探索燈盞細(xì)辛治療HIRI 的機(jī)制，為HIRI 的預(yù)防、治療提供研究方向。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果表明，燈盞細(xì)辛有9 個(gè)活性成分通過111 個(gè)靶點(diǎn)對抗HIRI，其中最重要的活性成分有木犀草素、槲皮素、山柰酚。有研究表明槲皮素對HIRI 具有保護(hù)作用[5]。木犀草素對腦、心臟和腎組織缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，主要機(jī)制涉及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等[6-8]，目前對于HIRI 的作用還需要進(jìn)一步研究。燈盞細(xì)辛與HIRI 的交集靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，核心靶點(diǎn)前10 位分別為TNF、AKT1、IL6、IL1B、VEGFA、TP53、PTGS2、CASP3、MMP9、HIF1A。IL6 是體內(nèi)重要的炎性介質(zhì)，主要來源于肝臟。TNF-α 能夠通過激活NF-κB 誘導(dǎo)IL6 的表達(dá)[9]。TNF-α 是TNF 的亞型，在肝臟缺血、缺氧時(shí)由激活的巨噬細(xì)胞釋放，TNF-α 可以趨化和激活中性粒細(xì)胞和白細(xì)胞[10]，加重肝細(xì)胞的損傷與壞死。GO 和KEGG 富集分析結(jié)果提示，燈盞細(xì)辛活性成分能夠調(diào)節(jié)基因表達(dá)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及凋亡和炎癥過程等，并通過AGE-RAGE 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、TNF 信號通路等對HIRI 起治療作用。RAGE（晚期糖基化終末產(chǎn)物受體）在肝臟中廣泛表達(dá)[11]，可激活促炎因子進(jìn)一步介導(dǎo)肝組織的損傷[12]。多種因素可通過PI3K-Akt 信號通路保護(hù)HIRI[13-14]。

綜上所述，燈盞細(xì)辛可通過多靶點(diǎn)、多通路對HIRI起到保護(hù)作用。目前通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接所得的結(jié)果為后續(xù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究指引了方向。