伏 毅，劉綿學(xué)，王 艷，高 鵬，黃 敏

(四川省原子能研究院，輻照保藏四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610101)

隨著核工業(yè)的發(fā)展，核安全事故也嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康，2021年日本宣布向太平洋排放核廢水更是對(duì)全人類(lèi)的生命健康造成威脅[1]。核技術(shù)應(yīng)用帶來(lái)的核污染如控制不利，將長(zhǎng)期威脅到人類(lèi)的健康與安全。放射性核素60Co廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)、放射醫(yī)療等行業(yè)，也發(fā)生過(guò)一些核安全事故[2-3]，核電站泄露產(chǎn)生的放射性污染中也存在60Co[4]，造成放射性污染，如20世紀(jì)90年代，在山西省忻州由于轉(zhuǎn)運(yùn)廢棄放射源時(shí)遺漏60Co廢料而造成重大核污染事故，導(dǎo)致多人死亡，因此，針對(duì)60Co的放射性污染處理技術(shù)開(kāi)發(fā)有著迫切的現(xiàn)實(shí)需求。

目前，用于核污染水體、土壤修復(fù)方法主要有物理法、化學(xué)法等[5-6]，然而這些技術(shù)需要復(fù)雜設(shè)備條件、巨額的花費(fèi)。而生物修復(fù)技術(shù)具有效率高、安全性能好、費(fèi)用低、易于管理與操作等優(yōu)點(diǎn)，在修復(fù)核素污染水體、土壤中的作用越來(lái)越重要。國(guó)內(nèi)外的研究表明利用微生物、植物吸附污染水體、土壤中的重金屬、核素是一種有效且價(jià)廉的修復(fù)污染的方式[7]，加上利用生物技術(shù)對(duì)植物、微生物的目的性改造，使生物修復(fù)技術(shù)具有巨大的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值[8]。

根瘤菌是生活在土壤中的革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌，在合適的條件下，根瘤菌能侵染豆科植物，通過(guò)類(lèi)菌體形式與豆科植物建立共生關(guān)系，使根的局部膨大形成根瘤，為植物提供氮源，同時(shí)植物供給根瘤菌以礦物養(yǎng)料和能源[9]。長(zhǎng)期研究中發(fā)現(xiàn)根瘤菌的活動(dòng)與鈷(Co)存在緊密的聯(lián)系，根瘤菌在其代謝活動(dòng)中可合成鈷胺素——一種含Co的維生素B類(lèi)大分子物質(zhì)；Co是根瘤菌與植物共生的必需元素，Dilworth等[10]報(bào)道缺Co導(dǎo)致根瘤短小，而恢復(fù)Co元素供應(yīng)后，側(cè)根上Co富集濃度增加。Riley等[11]報(bào)道在羽扇豆中由于土壤缺Co，造成根瘤菌浸染的種子成瘤率降為30%，未浸染種子的成瘤率降為13%。由于根瘤菌與Co元素的特殊關(guān)系，使利用根瘤菌修復(fù)Co污染水體、土壤具有易于回收的優(yōu)勢(shì)。目前，利用根瘤菌與植物共生修復(fù)銅[12-13]、鎘[14-15]、多環(huán)芳烴[16]等污染土壤均有報(bào)道，但是用于放射性核素60Co的報(bào)道較少。該研究分離純化采自多個(gè)地區(qū)的野生植物根瘤菌，對(duì)其進(jìn)行理化性質(zhì)分析和分子鑒定，并對(duì)純化菌株進(jìn)行模擬60Co耐受及吸附能力研究，探討根瘤菌用于放射性60Co污染水體、土壤修復(fù)的可能性。

1 材料與方法

1.1 菌株采集、分離與純化采摘自四川成都菜地、海南石碌銅礦區(qū)等地的大豆、紫花苜蓿、豬屎豆等植物根系(表1)，按照高亞梅等[17]的方法分離純化根瘤菌。

表1 供試菌株來(lái)源

1.2 菌株形態(tài)特征觀察按照張俊杰等[18]的方法進(jìn)行革蘭氏染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)、大小；在YMA 平板上培養(yǎng)72 h觀察菌落形態(tài)特征。

1.3 生理生化特征的測(cè)定依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[19]，用HB8540(青島海博)無(wú)氮培養(yǎng)基測(cè)定根瘤菌固氮類(lèi)型，用0.5%BTB YMA液體培養(yǎng)基測(cè)定根瘤菌產(chǎn)酸堿性。

1.4 分子鑒定菌體培養(yǎng)和根瘤菌總DNA提取參考谷峻等[20]的方法進(jìn)行。使用多位點(diǎn)序列分析方法對(duì)分離到的根瘤菌進(jìn)行分子鑒定。設(shè)計(jì)檢測(cè)引物位點(diǎn)為16S-IGS、nifH、recA，合成引物分別為16S-IGS(上游引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′，下游引物5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′)、nifH(上游引物5′- TAC GGN AAR GGS GGN ATC GGC AA -3′，下游引物5′- AGCATGTCYTCSAGYTCNTCCA -3′)、recA(上游引物5′- TTC GGC AAG GGM TCG RTS ATG -3′，下游引物5′- ACA TSA CRC CGA TCT TCA TGC -3′)。

PCR反應(yīng)總體積為50 μL，其中包括TaKaRa EXTaq酶0.25 μL、10×PCR緩沖液5 μL、MgCl24 μL、引物各2 μL、模板DNA 2 μL。PCR 程序：①16S-IGS，95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min，10 ℃10 min；②nifH，95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min，10 ℃10 min；③recA，95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min，10 ℃10 min。PCR產(chǎn)物由上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，使用blastn在線搜索高度相似序列，使用Mega 5.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，確定測(cè)試菌株的進(jìn)化分類(lèi)。

1.5 抗逆性試驗(yàn)以YMA培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。內(nèi)源抗生素抗性試驗(yàn)設(shè)置Amp/Kan/Str的終濃度為5、25、50、100 μg/L；耐鹽試驗(yàn)設(shè)NaCl終濃度為0、0.1%、0.5%、1.0%、5.0%、10.0%共6個(gè)梯度；酸堿試驗(yàn)設(shè)置pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0共11個(gè)梯度。分別接種后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)。接種后于第7天觀察結(jié)果。以上試驗(yàn)均設(shè)空白對(duì)照，3次重復(fù)，無(wú)菌操作。

1.6 根瘤菌輻照耐受能力測(cè)定YMA培養(yǎng)基中28 ℃搖菌48 h，6 000 r/min 5 min離心沉淀菌體，使用0.1 mol/L PBS緩沖液重懸細(xì)菌，重復(fù)3次后備用。使用60Co輻射源裝置對(duì)根瘤菌株進(jìn)行照射處理，輻照劑量為1、3、5、8、10 kGy；使用電子加速器對(duì)根瘤菌菌株進(jìn)行照射處理，輻照劑量為50、100、150、200、250 Gy；使用平板稀釋法計(jì)算致死率；以上試驗(yàn)均設(shè)無(wú)輻照空白對(duì)照，3次重復(fù)，無(wú)菌操作。

1.7 根瘤菌59Co耐受能力檢測(cè)配制含59Co濃度為0.1、0.2、0.5、1.0 mmol/L的YMA培養(yǎng)基。接種后于第7天觀察結(jié)果。以上試驗(yàn)均設(shè)空白對(duì)照，3次重復(fù)，無(wú)菌操作。

1.8 根瘤菌59Co吸附能力檢測(cè)將根瘤菌接種于50 mL YMA培養(yǎng)基中，28 ℃搖菌48 h，加入59CoCl2，使培養(yǎng)基中59Co終濃度為0.1 mmol/L，繼續(xù)搖菌0.5 h，12 000 r/min 5 min離心，收集上清，使用二甲酚橙-鈷標(biāo)準(zhǔn)曲線分光光度法檢測(cè)上清中殘留59Co的濃度，并計(jì)算根瘤菌對(duì)59Co的清除率。

使用Graphpad Prism 5軟件分析59CoCl2溶液濃度隨時(shí)間變化的趨勢(shì)，構(gòu)建吸附動(dòng)力學(xué)吸附反應(yīng)回歸方程，分析其吸附過(guò)程的反應(yīng)特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 根瘤菌細(xì)胞和菌落形態(tài)經(jīng)革蘭氏染色觀察，9株菌株均為短桿狀(圖1D)，革蘭氏染色陰性，無(wú)芽孢，能運(yùn)動(dòng)。在YMA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d 可形成直徑0.8～0.9 cm菌落，菌落為圓形，表面凸起光滑，半透明，邊緣整齊(圖1C)。

注：A.大豆根及根瘤；B.大豆根瘤；C.YMA-CR平板上的大豆根瘤菌菌落形態(tài)；D.根瘤菌細(xì)胞形態(tài)，鏡檢倍數(shù)為40×100倍

2.2 根瘤菌生理生化特征反應(yīng)1#、2#、6#、7#菌株在HB8540(青島海博)無(wú)氮培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢，屬于共生固氮菌；其余菌株屬于聯(lián)合固氮菌。0.5%BTB YMA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3～7 d測(cè)試，1#、2#、6#、7#菌株培養(yǎng)基呈藍(lán)色，產(chǎn)堿，為慢生菌株，生長(zhǎng)世代時(shí)間分別為9.87、10.26、29.50、15.60 h；3#、4#、5#、8#、9#菌株培養(yǎng)基均呈黃色，產(chǎn)酸，為快生菌株，生長(zhǎng)世代時(shí)間分別為7.63、4.82、5.03、6.68、11.41 h。

2.3 根瘤菌分子生物學(xué)鑒定recA基因是編碼細(xì)菌DNA重組蛋白的α亞基，與細(xì)菌修復(fù)系統(tǒng)行使功能相關(guān)[21]。nifH基因是根瘤菌共生固氮關(guān)鍵的基因，主要編碼根瘤菌固氮酶的組分Ⅱ中的鐵蛋白[22]。綜合16S-IGS、recA、nifH基因序列比對(duì)結(jié)果(圖2)，對(duì)9株根瘤菌進(jìn)行分類(lèi)，1#、2#、6#菌株為Bradyrhizobiumjaponicum，3#、8#菌株為Sinorhizobiummeliloti，4#、5#菌株為Rhizobiumsp.，7#菌株為Bradyrhizobiumyuanmingense，9#菌株為Rhizobiumhuautlense。

圖2 16S-IGS(A)、recA(B)、nifH(C)基因相似序列比對(duì)結(jié)果

2.4 根瘤菌的抗逆性測(cè)試

2.4.1pH適應(yīng)性。經(jīng)分析，1#～9#菌株在弱酸性到弱堿性(pH 3～8)培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)；3#、4#、8#、9#菌株在pH 10的培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，4#菌株生長(zhǎng)較差；3#、8#、9#菌株在pH 11的培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)；9#菌株在pH 12～13的培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)(表2)。

表2 根瘤菌菌株的pH適應(yīng)性

2.4.2鹽耐受性。從表3可以看出，1#、2#、6#、7#菌株在0.5% NaCl培養(yǎng)基中均不能生長(zhǎng)；3#、4#、5#、8#菌株在1.0% NaCl培養(yǎng)基中能生長(zhǎng)，但是所有菌株在5.0% NaCl培養(yǎng)基中均不能生長(zhǎng)。

表3 根瘤菌菌株的鹽耐受性

2.4.3天然抗生素抗性。具有抗生素抗性的根瘤菌能夠更好地在具有抗生素的環(huán)境中生存[23]，也有利于實(shí)驗(yàn)室對(duì)根瘤菌的篩選。通過(guò)對(duì)根瘤菌抗生素抗性的測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4#、5#、7#、8#、9#菌株具有天然Amp抗性，其中，4#、5#、7#、8#菌株最大能耐受100 μg/L的Amp，9#菌株最大能耐受50 μg/L的Amp(表4)；所有菌株均不具有Kan、Str抗性。

表4 根瘤菌菌株的天然抗生素抗性

2.5 根瘤菌輻照耐受能力檢測(cè)60Co輻照處理所有根瘤菌菌株，在1、3、5、8、10 kGy輻照劑量處理后，生長(zhǎng)7 d均無(wú)菌落出現(xiàn)，說(shuō)明1 kGy的60Co γ射線就能殺滅所有供試根瘤菌菌株。

利用電子加速器進(jìn)行低劑量的輻照處理，驗(yàn)證50～250 Gy輻照劑量處理后各根瘤菌菌株的生長(zhǎng)情況。從圖3可以看出，在100 Gy或以上的劑量照射后，均可使所有供試菌株無(wú)法生存；在50 Gy的電子束照射后，9#菌株的致死率最低。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，9株根瘤菌均對(duì)高劑量的輻照處理敏感，僅在低放射性的環(huán)境中能夠存活。

圖3 電子加速器輻照處理后根瘤菌的致死率

2.6 根瘤菌59Co耐受能力檢測(cè)從表5可以看出，5#菌株在0.1～0.5 mmol/L59Co培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，7#菌株僅能在0.1 mmol/L59Co培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其他菌株在0.1～0.2 mmol/L59Co培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)。

表5 根瘤菌59Co耐受性檢測(cè)

2.7 根瘤菌59Co吸附能力檢測(cè)如圖4所示，通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)根瘤菌后的培養(yǎng)基上清液中59Co含量，根瘤菌上清液中的殘留59Co含量均顯著降低，其中9#菌株上清液中殘余量最低，為加入菌株前的85%，即菌株對(duì)培養(yǎng)基中59Co的清除率為15%。1#～4#、6#、7#菌株上清液中59Co的殘余量均高于95%，圖中未列出，以對(duì)59Co耐受能力較好的5#菌株為代表。

圖4 培養(yǎng)基中59Co殘余百分比

3 結(jié)論

9#菌株具有耐強(qiáng)堿環(huán)境的生理特性，在pH≥13的環(huán)境中仍然能夠存活；9個(gè)菌株對(duì)鹽耐受性都不強(qiáng)，在5.0% NaCl環(huán)境中均不能生長(zhǎng)；4#、5#、7#、8#、9#菌株具有天然Amp抗性；9個(gè)菌株均對(duì)60Co產(chǎn)生的γ射線敏感，1 kGy輻照劑量即可殺死所有菌株；在100 Gy電子束輻照也能殺滅菌株，說(shuō)明篩選到的9個(gè)根瘤菌菌株只能在低放射性的環(huán)境中存活。相較于其他菌株，5#菌株對(duì)59Co具有較強(qiáng)的耐受性，在濃度達(dá)到0.5 mmol/L的培養(yǎng)環(huán)境中仍能生長(zhǎng)；9#菌株對(duì)培養(yǎng)基中59Co具有較強(qiáng)的清除能力，經(jīng)1.5 h培養(yǎng)清除率達(dá)到15%。5#菌株和9#菌株的發(fā)現(xiàn)對(duì)利用微生物修復(fù)59Co污染的水體、土壤具有一定的潛力。