■梁姝婕 羅平成 王偉唯 曹慶云 葉 慧 張常明 馮定遠(yuǎn) 左建軍

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642）

玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEA），是一種由鐮刀菌屬（主要是禾谷鐮刀菌）產(chǎn)生的具有雌激素活性的非甾醇類(lèi)毒素[1-2]，在霉變的谷類(lèi)作物（如玉米、大麥、小麥）中廣泛存在[3-4]。ZEA主要作用于動(dòng)物的生殖系統(tǒng)，具有很強(qiáng)的生殖毒性和免疫毒性，可導(dǎo)致后代畸形，對(duì)豬的影響最為嚴(yán)重[5]。ZEA 可通過(guò)食用被污染的飼料進(jìn)入家禽體內(nèi)，蛋雞中毒表現(xiàn)為雞冠腫大、卵巢萎縮、產(chǎn)蛋率下降和腹水癥[6-7]。張偉倫等[8]研究發(fā)現(xiàn)，ZEA影響蛋雞的產(chǎn)蛋率、雞蛋破損率和畸形率，并損害卵巢正常的組織結(jié)構(gòu)，造成卵母細(xì)胞萎縮、卵巢出血等現(xiàn)象。ZEA還可引起蛋雞肝細(xì)胞變性和壞死，導(dǎo)致肝臟中蛋白質(zhì)合成產(chǎn)生障礙[9]。目前ZEA對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能的影響已有相關(guān)的研究[8,10]，但是關(guān)于ZEA對(duì)種母雞繁殖性能及其后代影響的研究較少。因此，本試驗(yàn)以海南文昌種母雞為研究對(duì)象，在基礎(chǔ)飼糧中添加不同劑量ZEA，研究ZEA對(duì)種母雞以及子代的毒性作用，以期為種雞養(yǎng)殖提供一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

ZEA：純度≥99%，購(gòu)自青島普瑞邦生物工程有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組

試驗(yàn)選取產(chǎn)蛋率、體重、健康狀況相近的30周齡海南文昌種母雞共160 羽，采用單因子分組設(shè)計(jì)，隨機(jī)分成4 組，每組4 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10 羽。其中空白對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)飼糧中分別添加250、500 μg/kg和750 μg/kg ZEA。

1.3 試驗(yàn)飼糧

試驗(yàn)日糧配方參考中國(guó)肉雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 33—2004）和試驗(yàn)雞場(chǎng)文昌雞營(yíng)養(yǎng)需要企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)配制，基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及其營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)地點(diǎn)在恩平基龍有限公司的半開(kāi)放式棚舍進(jìn)行。在試驗(yàn)前將待選的母雞集中飼養(yǎng)7 d，根據(jù)產(chǎn)蛋率進(jìn)行分組調(diào)整，調(diào)整到每組產(chǎn)蛋率基本一致。預(yù)試期為7 d，統(tǒng)一飼喂一種商品全價(jià)飼料，正試期為36 d，各組飼喂相應(yīng)的飼糧。試驗(yàn)期間按照公司常規(guī)管理辦法對(duì)種母雞進(jìn)行管理，每天限飼90 g/只，自由飲水。

1.5 樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 種母雞

1.5.1.1 產(chǎn)蛋率與不合格種蛋率

從正式試驗(yàn)開(kāi)始，每天記錄產(chǎn)蛋數(shù)，并計(jì)算產(chǎn)蛋率和不合格種蛋率。

產(chǎn)蛋率（%）=產(chǎn)蛋數(shù)/產(chǎn)蛋母雞數(shù)量×100

不合格種蛋率（%）=不合格種蛋/總產(chǎn)蛋數(shù)×100

1.5.1.2 蛋品質(zhì)

在正式試驗(yàn)第36天，每個(gè)重復(fù)收集3個(gè)蛋，每組共12個(gè)，進(jìn)行蛋形指數(shù)、蛋黃顏色、蛋殼強(qiáng)度、蛋殼厚度、哈夫單位的測(cè)定。蛋形指數(shù)是使用游標(biāo)卡尺測(cè)量蛋的長(zhǎng)徑與短徑后計(jì)算得出，蛋黃顏色由比色卡對(duì)比得出，分別使用蛋殼強(qiáng)度計(jì)和螺旋測(cè)微器測(cè)定蛋殼強(qiáng)度和厚度。

蛋形指數(shù)=長(zhǎng)徑/短徑

哈夫單位=100lg（H-1.7W0.37+7.6）

式中：H——蛋白高度（mm）；

W——蛋重（g）。

1.5.1.3 血清性激素水平

在正式試驗(yàn)第36 天，每個(gè)重復(fù)選取3只種母雞，每組共12只，采集全血后4 000 r/min 離心20 min，收集并分裝血清，-20 ℃下保存，用于測(cè)定血清雌二醇（E2）、促卵泡激素（FSH）、促黃體生成素（LH）的濃度。

1.5.1.4 卵泡發(fā)育

在正式試驗(yàn)第36天，每個(gè)重復(fù)選取3只種母雞，每組共12只，屠宰后統(tǒng)計(jì)其卵泡數(shù)量，計(jì)算卵泡閉鎖率。

卵泡閉鎖率（%）=閉鎖卵泡數(shù)/小于等于4 mm卵泡總數(shù)×100

1.5.1.5 肝臟指數(shù)

在正式試驗(yàn)期第36天，每個(gè)重復(fù)選取3只種母雞，每組共12只，屠宰后稱(chēng)量其肝臟重，計(jì)算肝臟指數(shù)。

器官指數(shù)（g/kg）=器官重/屠體重

1.5.1.6 腸道形態(tài)

在正式試驗(yàn)第36 天，每個(gè)重復(fù)選取1 只種母雞，屠宰后取空腸前段1～2 cm 組織保存在4%多聚甲醛溶液中，石蠟包埋后制作切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosinstaining，H.E.）染色，顯微鏡下觀察、測(cè)量其絨毛高度、隱窩深度，計(jì)算絨毛高度與隱窩深度的比值。

1.5.1.7 孵化性能

在正式試驗(yàn)期第27、30、33 天時(shí)，每個(gè)重復(fù)選20 枚蛋，每組共80 枚，進(jìn)行孵化，并在對(duì)應(yīng)的出苗日進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算受精率、孵化率和健雛率。

1.5.2 子代小雞

選取正式試驗(yàn)期第33～36 天的種蛋孵化的雌性小雞，待30日齡小雞階段結(jié)束后，每個(gè)重復(fù)選取2只，每組共8只，稱(chēng)重后屠宰，剖取心臟、脾臟、肝臟、腎臟和法氏囊進(jìn)行稱(chēng)重，計(jì)算器官指數(shù)。取空腸前段1～2 cm 組織保存在4%多聚甲醛溶液中，石蠟包埋后制作切片，進(jìn)行H.E.染色，顯微鏡下觀察、測(cè)量其絨毛高度、隱窩深度，計(jì)算絨毛高度與隱窩深度的比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（oneway ANOVA），在差異顯著的基礎(chǔ)上采用LSD 方法進(jìn)行多重比較以及線性（linear）和二次曲線（quadratic）趨勢(shì)分析，結(jié)果采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著，其中0.05＜P＜0.10表示具有差異趨勢(shì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧添加ZEA對(duì)種母雞繁殖性能與臟器性狀的影響

2.1.1 飼糧添加ZEA 對(duì)種母雞產(chǎn)蛋性能的影響（見(jiàn)表2）

由表2 可知，添加不同劑量ZEA，在數(shù)值上降低了產(chǎn)蛋率，但無(wú)顯著差異（P＞0.05），750 μg/kg 組的不合格種蛋率在數(shù)值上高于對(duì)照組和250、500 μg/kg組（P＞0.05）。

表2 飼糧添加ZEA對(duì)種母雞產(chǎn)蛋性能的影響（%）

2.1.2 飼糧添加ZEA對(duì)種母雞蛋品質(zhì)的影響（見(jiàn)表3）

表3 飼糧添加ZEA對(duì)蛋品質(zhì)的影響

由表3 可知，不同劑量ZEA 對(duì)種蛋的蛋黃顏色、哈夫單位、蛋形指數(shù)均無(wú)顯著影響（P＞0.05）。與對(duì)照組相比，250 μg/kg組種蛋的蛋殼強(qiáng)度有升高的趨勢(shì)，但無(wú)顯著差異（P=0.060），隨著ZEA劑量的提高，種蛋的蛋殼強(qiáng)度呈二次曲線降低（P=0.030）。500 μg/kg 組和750 μg/kg 組種蛋的蛋殼厚度顯著低于250 μg/kg組（P＜0.05）。

2.1.3 飼糧添加ZEA對(duì)種蛋孵化性能的影響（見(jiàn)表4）

表4 飼糧添加ZEA對(duì)種蛋孵化性能的影響（%）

由表4 可知，不同劑量ZEA 處理后，種蛋的受精率和孵化率在數(shù)值上低于對(duì)照組，但無(wú)顯著差異（P＞0.05）。試驗(yàn)組的健雛率與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.1.4 飼糧添加ZEA 對(duì)種母雞肝臟指數(shù)的影響（見(jiàn)表5）

表5 飼糧添加ZEA對(duì)種母雞肝臟指數(shù)的影響(g/kg)

由表5可知，不同劑量ZEA處理后種母雞的肝臟指數(shù)在數(shù)值上有所降低，但無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.1.5 飼糧添加ZEA 對(duì)種母雞空腸形態(tài)的影響（見(jiàn)表6）

表6 飼糧添加ZEA對(duì)種母雞空腸形態(tài)的影響

由表6可知，不同劑量ZEA對(duì)種母雞空腸的絨毛高度、隱窩深度以及絨毛高度/隱窩深度比值均無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

2.1.6 飼糧添加ZEA 對(duì)種母雞血清性激素水平的影響（見(jiàn)表7）

由表7 可知，不同劑量ZEA 對(duì)種母雞血清中E2、FSH、LH濃度均無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

表7 飼糧添加ZEA對(duì)種母雞血清性激素濃度的影響（IU/L）

2.1.7 飼糧添加ZEA對(duì)種母雞卵泡閉鎖率的影響（見(jiàn)表8）

由表8 可知，與對(duì)照組相比，不同劑量ZEA 處理后種母雞的卵泡閉鎖率在數(shù)值上均有所升高，但無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表8 飼糧添加ZEA對(duì)種母雞卵泡閉鎖率的影響（%）

2.2 飼糧添加ZEA對(duì)子代小雞體重和臟器性狀的影響

2.2.1 飼糧添加ZEA對(duì)子代小雞體重的影響（見(jiàn)表9）

由表9 可知，與對(duì)照組相比，不同劑量ZEA 對(duì)種母雞子代30日齡時(shí)的體重均無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

表9 飼糧添加ZEA對(duì)子代小雞體重的影響（g）

2.2.2 飼糧添加ZEA對(duì)子代30日齡小雞器官指數(shù)的影響（見(jiàn)表10）

由表10可知，與對(duì)照組相比，不同劑量ZEA處理后子代小雞的肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)在數(shù)值上有所升高，心臟指數(shù)在數(shù)值上有所降低，但無(wú)顯著差異（P＞0.05）。與對(duì)照組相比，不同劑量ZEA 處理對(duì)子代法氏囊指數(shù)無(wú)顯著影響（P＞0.05）。與對(duì)照組相比，250 μg/kg 組顯著降低了子代小雞的脾臟指數(shù)（P＜0.05）。500 μg/kg 組和750 μg/kg 組子代小雞的脾臟指數(shù)均顯著高于250 μg/kg組（P＜0.05）。

表10 飼糧添加ZEA對(duì)子代小雞器官指數(shù)的影響（g/kg）

2.2.3 飼糧添加ZEA對(duì)子代空腸形態(tài)的影響（見(jiàn)表11）

由表11 可知，各處理組之間空腸的絨毛高度、隱窩深度和絨毛高度/隱窩深度值均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表11 飼糧添加ZEA對(duì)子代小雞空腸形態(tài)的影響

3 討論

3.1 飼糧添加ZEA對(duì)種母雞繁殖性能與臟器性狀的影響

3.1.1 飼糧添加ZEA對(duì)種母雞生產(chǎn)性能的影響

在有關(guān)ZEA的研究中，對(duì)于哺乳動(dòng)物的研究相對(duì)較多。關(guān)于單一ZEA 污染對(duì)種母雞生產(chǎn)性能造成影響的報(bào)道較少，其中大多數(shù)相關(guān)研究表明ZEA對(duì)種母雞的生產(chǎn)性能沒(méi)有顯著影響。

Allen 等[11]研究中，分別以純品ZEA 添加量為0、10、25、50、100、200、400、800 mg/kg 的飼糧飼喂30 周齡白萊航產(chǎn)蛋種母雞，發(fā)現(xiàn)各濃度ZEA的處理對(duì)種母雞的產(chǎn)蛋性能、雞蛋尺寸、飼料消耗量、體重、孵化性能、孵化率、子代前3 周生產(chǎn)性能、蛋殼厚度、蛋哈夫單位均沒(méi)有顯著影響。Branton等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，用含有298 μg/kg DON 以及1 102 μg/kg ZEA 的混合污染高粱飼糧飼喂23周齡白來(lái)航母雞24周，在試驗(yàn)期間，沒(méi)有對(duì)母雞產(chǎn)蛋率造成顯著影響。ZEA 可降低白來(lái)航母雞的蛋比重和蛋殼厚度[13]。張偉倫等[8]發(fā)現(xiàn)ZEA影響270 日齡海蘭粉蛋雞的產(chǎn)蛋率，1 mg/kg ZEA 增加雞蛋的破損率和畸形率，但是2 mg/kg ZEA 反而降低雞蛋破損率和畸形率。

在本研究中，飼糧中添加不同劑量ZEA在數(shù)值上降低了種母雞的產(chǎn)蛋率、受精率和孵化率，對(duì)蛋品質(zhì)中的哈夫單位、蛋形指數(shù)、蛋黃顏色等均沒(méi)有產(chǎn)生顯著影響，但是健雛率有所增加，與張偉倫等[8]研究相似。蛋殼強(qiáng)度與蛋殼厚度方面的趨勢(shì)比較一致，與對(duì)照組相比，250 μg/kg 組種蛋的蛋殼強(qiáng)度有升高的趨勢(shì)，隨著ZEA 劑量的提高，種蛋的蛋殼強(qiáng)度有降低的趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，250 μg/kg組種蛋的蛋殼厚度有升高的趨勢(shì)，500 μg/kg 組和750 μg/kg 組種蛋的蛋殼厚度顯著低于250 μg/kg組。

本研究的有關(guān)結(jié)果與前人的試驗(yàn)結(jié)果較為一致，但添加250 μg/kg ZEA在數(shù)值上提高了種蛋的蛋殼強(qiáng)度和蛋殼厚度，需要做進(jìn)一步的研究。關(guān)于750 μg/kg組蛋殼強(qiáng)度相對(duì)較低，這可能提示ZEA對(duì)于種母雞輸卵管的子宮部位的鈣代謝相關(guān)機(jī)制有一定的影響，但是相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

3.1.2 飼糧添加ZEA 對(duì)種母雞臟器及腸道形態(tài)的影響

在關(guān)于ZEA 對(duì)非繁殖系統(tǒng)的臟器以及腸道形態(tài)影響方面，鮮見(jiàn)ZEA對(duì)種母雞臟器有顯著影響的研究報(bào)道，現(xiàn)有的報(bào)道對(duì)ZEA 在這方面的作用還存在爭(zhēng)議，對(duì)于腸道形態(tài)方面鮮有報(bào)道。

Chi 等[14]選取1 日齡肉雞（Indian River?，公母對(duì)半）分成6 組，在飼糧中分別添加0、10、25、50、100、200、400、800 mg/kg純品ZEA，飼喂至21日齡，結(jié)果表明，各組間肉雞的器官指數(shù)（肝臟、心臟、脾臟、睪丸、輸卵管、卵巢、法氏囊）均沒(méi)有顯著差異。但是朱碧波等[15]關(guān)于ZEA 對(duì)肉雞肝臟氧化損傷方面的研究中，結(jié)果表明飼糧中添加2 mg/kg ZEA 對(duì)肉雞肝臟具有氧化損傷的作用。ZEA 可嚴(yán)重?fù)p傷270 日齡海蘭粉蛋雞的肝臟結(jié)構(gòu)，引起肝細(xì)胞變性、壞死和纖維化，并出現(xiàn)相應(yīng)的肝功能下降[9]。楊美璐[16]研究發(fā)現(xiàn)1 500～3 500 μg/kg ZEA 不影響育成期蛋雞肝臟、腎臟及生殖器官發(fā)育指數(shù)，但對(duì)其組織形態(tài)學(xué)有一定的病理影響。這些研究說(shuō)明ZEA 可引起肝臟氧化應(yīng)激而造成損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生炎癥[17-18]。在本研究中，不同劑量ZEA處理在數(shù)值上降低了種母雞的肝臟指數(shù)，與前人的研究結(jié)果一致，具體的損傷機(jī)制需要從分子生物學(xué)層面做進(jìn)一步的研究。

在前人的研究中，未見(jiàn)ZEA對(duì)雞腸道健康的相關(guān)負(fù)面報(bào)道。在本試驗(yàn)中，不同劑量ZEA對(duì)種母雞的空腸形態(tài)沒(méi)有顯著影響，可能與家禽較強(qiáng)的腸肝循環(huán)和排泄能力、毒素在臟器中的殘留時(shí)間短和殘留量少以及產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物毒性低有關(guān)[19]。

3.1.3 飼糧添加ZEA 對(duì)種母雞繁殖系統(tǒng)和性激素水平的影響

ZEA可對(duì)動(dòng)物的生殖系統(tǒng)造成一定的負(fù)面影響，但是關(guān)于種母雞血清性激素、卵泡閉鎖率的相關(guān)報(bào)道相對(duì)較少。

Chi 等[14]選取1 日齡肉雞（Indian River?，公母對(duì)半）分成6 組，在飼糧中分別添加0、10、25、50、100、200、400、800 mg/kg純品ZEA，飼喂至21日齡，結(jié)果表明，與其他各組相比，400 mg/kg和800 mg/kg組的白細(xì)胞總數(shù)因?yàn)榭偭馨图?xì)胞的減少而顯著減少；各組間紅細(xì)胞、血紅蛋白含量以及各項(xiàng)血清生化指標(biāo)（鈣含量、磷含量、總蛋白濃度、堿性磷酸酶濃度、膽固醇含量）沒(méi)有顯著差異。楊美璐[16]研究發(fā)現(xiàn)1 500～3 500 μg/kg ZEA顯著影響育成期蛋雞的血液生理生化、血清抗氧化和血清激素水平，并隨時(shí)間的增長(zhǎng)，毒性逐漸積累。凌阿茹等[10]研究發(fā)現(xiàn)ZEA 劑量高于5 mg/kg 時(shí)，損傷34 周齡海蘭褐蛋雞的卵巢機(jī)能，干擾性激素分泌。張偉倫等[8]發(fā)現(xiàn)ZEA可造成卵巢充血、出血、卵母細(xì)胞萎縮、卵泡間質(zhì)細(xì)胞群增多并水腫的現(xiàn)象。

本試驗(yàn)的有關(guān)研究表明不同劑量ZEA 對(duì)種母雞血清中E2、FSH、LH 濃度均沒(méi)有顯著影響。關(guān)于卵泡閉鎖率的結(jié)果顯示，不同劑量ZEA處理后種母雞的卵泡閉鎖率在數(shù)值上高于對(duì)照組。本試驗(yàn)關(guān)于種母雞的研究沒(méi)有找到直接的參考依據(jù)，前人有關(guān)哺乳動(dòng)物的研究表明，ZEA 具有刺激機(jī)體產(chǎn)生雌二醇的作用[20-22]，但是在本研究中該作用未能體現(xiàn)出來(lái)，ZEA及其代謝產(chǎn)物的雌激素活性在本研究中并未起到對(duì)機(jī)體本身這三種性激素產(chǎn)生影響的作用。

3.2 飼糧添加ZEA對(duì)種母雞后代生長(zhǎng)發(fā)育的影響

鮮見(jiàn)ZEA對(duì)種母雞后代生長(zhǎng)發(fā)育情況的研究，但是有少量研究實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的相關(guān)報(bào)道。高鑫等[23]關(guān)于ZEA對(duì)大鼠生殖發(fā)育跨代毒性的研究表明，在日糧中添加5～20 mg/kg ZEA 會(huì)導(dǎo)致妊娠雌性大鼠采食量和體重的顯著降低，但是產(chǎn)仔數(shù)沒(méi)有顯著差異，其中20 mg/kg ZEA會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)仔存活率顯著降低，也會(huì)導(dǎo)致其后代雌性小鼠的體重顯著下降。Xu等[24]研究發(fā)現(xiàn)，ZEA可誘導(dǎo)雛雞肝臟和腎臟組織結(jié)構(gòu)紊亂、細(xì)胞脫落和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

在本研究中，不同劑量ZEA 對(duì)子代小雞階段的體重?zé)o顯著影響。但是子代在器官指數(shù)方面出現(xiàn)了一定程度的差別，與對(duì)照組相比，不同劑量ZEA 處理在數(shù)值上升高了子代小雞的肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù)，降低了心臟指數(shù)。250 μg/kg 組子代小雞的脾臟指數(shù)顯著低于對(duì)照組，500 μg/kg 組和750 μg/kg 組子代小雞的脾臟指數(shù)顯著高于250 μg/kg 組。但是這樣的差別并未出現(xiàn)對(duì)于ZEA 的劑量效應(yīng)關(guān)系，目前尚未發(fā)現(xiàn)充分的證據(jù)可對(duì)這樣的差別進(jìn)行充分說(shuō)明。

對(duì)于這一部分的結(jié)果，ZEA對(duì)子代生長(zhǎng)沒(méi)有呈現(xiàn)劑量效應(yīng)的影響，與針對(duì)大鼠的試驗(yàn)相對(duì)比可能是因?yàn)榉N間差異以及使用劑量的懸殊導(dǎo)致了試驗(yàn)結(jié)果的差異，也可能與之前提到的ZEA在種母雞體內(nèi)的代謝情況以及家禽對(duì)ZEA不敏感有關(guān)[19,25]。

4 結(jié)論

飼糧中添加500、750 μg/kg ZEA可顯著降低文昌種母雞的蛋殼厚度，對(duì)其產(chǎn)蛋性能、孵化性能以及子代生長(zhǎng)發(fā)育等重要的繁殖性狀影響不顯著，且在本試驗(yàn)條件下不存在劑量效應(yīng)關(guān)系。