■德勒黑 楊 斌 薩茹麗* 錢琳娜 陳樂祥 吳蘇日古嘎

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院獸醫(yī)研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；3.通遼市畜牧業(yè)發(fā)展中心，內(nèi)蒙古通遼 028000）

隨著現(xiàn)代科技、醫(yī)學技術(shù)的發(fā)展，研究人員逐漸發(fā)現(xiàn)了沙棗葉具有清熱解毒、抗菌消炎、活血化瘀的藥用價值。目前，世界上一共有90多種沙棗，廣泛生長在亞洲、歐洲和北美地區(qū)[1]。沙棗樹也叫桂香柳，生長于內(nèi)蒙古自治區(qū)西部沙漠里，是一種抗旱、抗寒能力極強的沙生植物。在現(xiàn)代園林綠化中沙棗也具有一定的生態(tài)和經(jīng)濟效益，可用于防風固林、美化環(huán)境和防止侵蝕[2]。許多植物的果實、花、種子和葉子中含有酚類化合物和黃酮類化合物等天然來源的活性化合物，由于它們能夠釋放電子和清除自由基，因此具有抗氧化活性[1]。有關(guān)研究報道，沙棗水提物可有效降低四氧嘧啶誘導糖尿病小鼠的血糖水平[3]。近年來，由于抗生素耐藥微生物引起的疾病發(fā)生率增加，利用具有天然抗菌活性的藥用植物的研究呈高增長勢頭[4]。沙棗果實提取物中含有類黃酮化合物、多糖、谷甾醇、萜類、香豆素、酚羧酸、氨基酸、皂苷、類胡蘿卜素、維生素和單寧[5-7]。Liu 等[8]發(fā)現(xiàn)金絲小棗酚酸類化合物的主要成分為原兒茶酸、兒茶酚、對羥基苯甲酸、香草酸和對香豆酸，其含量分別為17.02、5.87、7.46、2.95、1.06 mg/g。研究表明，攝入具有抗氧化特性的膳食抗氧化劑、水果或蔬菜，可提高生活質(zhì)量，延緩衰老及降低退行性疾病的發(fā)生[9]。目前國內(nèi)外學者對于植物提取物抗菌及抗氧化等方面的研究較多，但沙棗葉及其提取物的抗菌、抗氧化研究較少。本試驗通過對沙棗葉提取物的體外抗氧化以及抗菌作用進行研究，綜合評價沙棗葉提取物體外抗菌、抗氧化活性，以期為沙棗葉的綜合開發(fā)利用提供實際應(yīng)用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

沙棗葉：采摘自內(nèi)蒙古呼和浩特市托克托縣永勝域村。

菌種：大腸桿菌（Escherichia coli）、白葡萄球菌（Staphylococcus albus）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、變形桿菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、馬鏈球菌（Stretpococcus equi），由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科院獸醫(yī)研究所實驗室提供。濾菌膜、移液器、移液管、一次性注射器、牛津杯（45～50個）、小燒杯50 mL×10個。

1.2 試驗試劑及儀器

試劑：總抗氧化能力（T-AOC）測定試劑盒（ABTS法）、1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH）清除能力試劑盒、羥自由基測定試劑盒、抑制與產(chǎn)生超氧陰離子（·O2-）試劑盒，以上所有試劑盒均購買自南京建成生物工程研究所有限公司。

藥物：生理鹽水、血清（孕馬血清）、青霉素、氯化鈉（NaCl）（天津市福晨化學試劑有限公司）；胰蛋白胨Tryptone（英國）、酵母提取物Yeast Extract（法國）、無水乙醇（天津市登科化學試劑有限公司）、瓊脂Agar（英國）等。

試驗儀器：全自動酶標儀（美國BIOTEK 公司的Synergy-HT型）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、移液槍（大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司）、96孔酶標板、循環(huán)水式真空泵、全溫雙層振蕩培養(yǎng)箱（金壇市盛藍儀器制造有限公司）、SW-CJ-1F超凈工作臺（蘇州廣源凈化工程有限公司）

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

沙棗葉水提取物的制備：首先將沙棗葉低溫烘干，之后進行粉碎處理，然后將粉碎的沙棗葉分裝為300 g/包，每包鍋中加入5～10倍純化水煮3次，每次大火煮1 h，再將經(jīng)煮3 次的沙棗葉水提物合并過濾濃縮至300 mL，得濃度為1 g/mL 原液。用純化水將沙棗葉水提物原液（1 g/mL）依次稀釋為500、333、250、200、100、50、20、10 mg/mL濃度的待測液。

沙棗葉乙醇提取物的制備：稱取經(jīng)粉碎沙棗葉120 g置于3 000 mL燒杯中，加入2 400 mL 70%乙醇（720 mL純化水+1 680 mL無水乙醇）混勻后置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)60 ℃下微搖2 h，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至120 mL，得濃度為1 g/mL的沙棗葉醇提物原液，原液-20 ℃冰箱保存。臨用前使用70%無水乙醇將沙棗葉醇提物原液（1 g/mL）稀釋成濃度為500、333、250、200、100、50、20、10 mg/mL的待測液。

1.3.2 抑菌活性的測定

抑菌活性的強弱通過抑菌圈直徑的大小表示，直徑越大抑菌能力越強，反之越弱。先將7～8 mL 固體培養(yǎng)基（LA）均勻倒入培養(yǎng)皿中，凝固后用鑷子將無菌的牛津杯輕輕放入培養(yǎng)皿中，在水平放置的平皿中放置3只牛津杯，其間距相等，在小燒杯中倒入30 mL固體培養(yǎng)基再接種200 μL 菌懸液并搖晃均勻，再倒進培養(yǎng)皿，待培養(yǎng)基凝固后，取出放置的牛津杯，吸取試驗藥物溶液150 μL 至牛津杯孔中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16～18 h。青霉素作為陽性對照組，無水乙醇為空白對照組，16～18 h后觀察是否有抑菌效果，并用游標卡尺測量抑菌圈直徑（mm）。測量3個抑菌圈直徑，結(jié)果以3次的平均值進行計算。抑菌效果判定：抑菌圈直徑≤8 mm為不敏感；抑菌圈直徑8～13 mm為低度敏感；抑菌圈直徑13～19 mm為中度敏感；抑菌圈直徑＞19 mm為高度敏感[10]；“-”為無抑菌活性。

1.3.3 體外抗氧化活性的測定

沙棗葉提取物體外總抗氧化能力（T-AOC）、清除DPPH自由基的能力以及羥自由基清除能力和抑制超氧陰離子自由基的測定方法按照南京建成生物工程研究所有限公司所提供的試劑盒說明書進行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)均使用Excel制作成表格初步作圖整理后，采用SAS9.2 軟件進行方差分析，P＜0.05 視為差異顯著，P＞0.05 視為差異不顯著，數(shù)據(jù)為“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棗葉提取物體外抑菌活性（見表1）

從表1數(shù)據(jù)可知，在試驗中1 g/mL 濃度沙棗葉醇提物對大腸桿菌、白葡萄球菌、綠膿桿菌、變形桿菌、馬鏈球菌等5種菌的抑菌能力均為中度敏感（抑菌圈直徑13～19 mm），對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌為低度敏感（抑菌圈直徑8～13 mm）。500 mg/mL濃度沙棗葉醇提物對大腸桿菌、白葡萄球菌、綠膿桿菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌中度敏感，對枯草芽孢桿菌和馬鏈球菌為低度敏感。333 mg/mL濃度沙棗葉醇提物對大腸桿菌、白葡萄球菌、綠膿桿菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌為中度敏感，對枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌及馬鏈球菌為低度敏感。250 mg/mL濃度沙棗葉醇提物對大腸桿菌、白葡萄球菌、綠膿桿菌及金黃色葡萄球菌為中度敏感，對變形桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌及馬鏈球菌為低度敏感。200 mg/mL 濃度的沙棗葉醇提物對大腸桿菌、白葡萄球菌、綠膿桿菌及變形桿菌為低度敏感，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌及馬鏈球菌為不敏感（抑菌圈直徑≤8 mm）。100、50、20、10 mg/mL 濃度的沙棗葉醇提物對上述8種菌均為不敏感或無抑菌活性。沙棗葉水提物各濃度樣品對上述8種菌均為不敏感（抑菌圈直徑≤8 mm）或無抑菌活性。

表1 不同濃度沙棗葉提取物對8種菌的抑菌圈直徑(mm)

2.2 沙棗葉提取物體外總抗氧化能力（見表2）

表2 沙棗葉提取物總抗氧化能力

從表2可知，沙棗葉提取物總抗氧化能力對比空白對照組差異顯著（P＜0.05），沙棗葉水提物與醇提物之間差異不顯著（P＞0.05）。沙棗葉水提物的總抗氧化能力高于空白對照組和沙棗葉醇提物。

2.3 沙棗葉提取物體外清除DPPH自由基的能力（見表3）

表3 沙棗葉提取物DPPH自由基清除能力(μg Tro lox/g)

從表3 可知，沙棗葉提取物濃度由原液（1 g/mL）至測定100 倍（10 mg/mL）稀釋濃度，DPPH 自由基清除能力呈下降趨勢。沙棗葉水提物1 g/mL 組和500 mg/mL 組清除DPPH 自由基能力高于醇提物1 g/mL 組和500 mg/mL 組，二者之間差異顯著（P＜0.05）。沙棗葉水提物、醇提物原液（1 g/mL）和2 倍（500 mg/mL）濃度的清除能力高于其他稀釋倍數(shù)的清除能力，沙棗葉提取物原液（1 g/mL）的清除能力顯著其他測定組（P＜0.05），隨著測定樣品稀釋濃度的下降，清除能力呈不同程度降低。

2.4 沙棗葉提取物對羥自由基的抑制作用（見圖1）

圖1 可以看出，沙棗葉醇提物原液（1 g/mL）到100 mg/mL 濃度的抑制率具有緩慢上升趨勢，到達100 mg/mL濃度后迅速下降。沙棗葉水提物從1 g/mL濃度到200 mg/mL 濃度抑制率迅速上升，200 mg/mL開始其上升趨勢平緩，且其抑制率隨其濃度的下降而提高。在100 mg/mL濃度以下，沙棗葉醇提物對抑制羥自由基能力明顯弱于水提物。

2.5 沙棗葉提取物對超氧陰離子自由基的抑制作用（見圖2）

如圖2 所示，沙棗葉醇提物隨著其濃度降低，其抑制率也跟著緩慢下降，從不同提取物及不同濃度組間的比較可以看出，醇提1 g/mL、500 mg/mL濃度的抑制率顯著高于其他濃度組（P＜0.05）。在不同提取物同濃度比較時，100 mg/mL、50 mg/mL、20 mg/mL 濃度抑制率差異不顯著（P＞0.05）。與水提物各濃度組相比，醇提物各濃度抑制率稍強，醇提物抑制率隨著濃度下降更為陡峭。沙棗葉醇提物對超氧陰離子自由基具有明顯抑制能力且表現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。

3 討論

3.1 沙棗葉提取物體外抗菌活性

近年來，隨著飼料禁抗時代的到來，將尋找天然抗生素替代品的研究逐步推向了高潮。近些年對于天然植物提取物的抗菌活性研究非常廣泛，也取得了一定的研究成果。家畜日糧中添加適量的植物提取物可以提高動物免疫力[11]。大量的研究表明，天然植物提取物中的生物活性成分具有抗菌功效，在謝永華等[12]欖綠粗葉木水提物體外抗菌效果的初步探討試驗中，發(fā)現(xiàn)欖綠粗葉木水提物對金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌高度敏感，對枯草芽孢桿菌中度敏感，對銅綠假單胞菌低敏感，而對大腸桿菌無抑制效果。Singh 等[13]研究發(fā)現(xiàn)粗莖老鸛草根的乙醇提物和乙醚提物對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性病原體均具有顯著的抗菌作用。Tran 等[14]研究發(fā)現(xiàn)金銀花和四角楓甲醇提取物對大腸桿菌、嗜水氣單胞菌和無乳鏈球菌3 種菌具有顯著的抗菌活性。吳小詩等[15]的訶子水提物體內(nèi)外抗菌作用及止癢效果研究試驗結(jié)果表明，水提物對馬拉色菌感染模型具有良好的治療作用，有望成為抗菌止癢且溫和的去屑止癢產(chǎn)品的有效活性成分。沙棗作為西北部地區(qū)特有的沙生植物，其抗菌作用也逐漸被人們發(fā)覺。本次試驗中1 g/mL、500 mg/mL、333 mg/mL、250 mL、200 mL 濃度沙棗葉醇提物對大腸桿菌、白葡萄球菌、綠膿桿菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌具有一定的抗菌作用，其他濃度沙棗葉醇提物對上述8 種菌不敏感或無抗菌活性，其抗菌活性與其醇提物濃度和受試菌菌種類型有關(guān)。沙棗葉水提物各濃度樣品對上述8 種菌均為不敏感或無抑菌活性。買買提吐爾·克力木等[16]選用新疆沙棗水提液和濃縮物研究其抗菌活性，得出沙棗水提取物對受試菌無顯著抗菌活性，對福式痢疾桿菌有微弱的抗菌效果。從結(jié)果中可以看出，隨著水提物濃度的降低，其對一些受試菌的抗菌效果逐漸提高。因此推斷沙棗葉水提物的抗菌活性可能與其受試菌種及濃度有關(guān)，后續(xù)可以從沙棗葉其他活性成分作為研究對象更加深入地研究其抗菌活性。

3.2 沙棗葉提取物體外抗氧化活性

畜禽機體產(chǎn)生過多的自由基會對其細胞功能有所損壞，從而導致動物生產(chǎn)性能下降。植物提取物可清除有害自由基，增強機體抗氧化能力，有效預(yù)防氧化應(yīng)激造成的機體損傷[17]。抗氧化劑的化學結(jié)構(gòu)多樣，作用機制各不相同，其關(guān)鍵機制是抗氧化劑與自由基反應(yīng)形成相對穩(wěn)定的非活性產(chǎn)物[18]。Hamidpour 等[19]研究沙棗乙酸乙酯提取物的抗氧化和抗腫瘤活性，隨著各樣品濃度和極性水平的增加，其抗氧化能力逐漸提高了。馮濤等[20]使用超聲波和離心結(jié)合的方法，以沙棗果實為材料，用70%乙醇提取的沙棗果肉對羥基自由基和過氧化物自由基的清除效果最好，其中羥基自由基的清除率更是高于河北棗和維生素E。本試驗中沙棗葉醇提物清除羥自由基能力及抑制超氧陰離子能力的結(jié)果與其一致，因此推斷，沙棗葉提取物體外抗氧化活性與其濃度呈劑量效應(yīng)關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)沙棗葉乙醇提取物可通過調(diào)整體內(nèi)的氧化與抗氧化系統(tǒng)，降低白細胞介素-4（IL-4）及免疫球蛋白E（IgE）的含量、升高γ干擾素（IFN-γ）的含量，調(diào)節(jié)Th1細胞/Th2 細胞免疫平衡而改善哮喘模型小鼠氣道炎癥[21]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，高濃度沙棗葉醇提物抗氧化活性良好，總抗氧化能力及清除DPPH自由基能力沙棗葉水提物各濃度略高于醇提物，但在清除羥自由基能力及抑制超氧陰離子能力測定結(jié)果中沙棗葉醇提物顯著高于水提物。在后期的研究中需向沙棗葉醇提物方面進行更加深入的研究，進一步開發(fā)沙棗葉生物活性功能，有利于其飼料添加劑潛力的開發(fā)，為現(xiàn)代畜牧業(yè)做出新貢獻。

4 結(jié)論

①沙棗葉醇提物具有良好的抗菌活性，且其抗菌活性與其醇提物濃度和受試菌菌種類型有關(guān)，而沙棗葉水提物均無顯著的抗菌活性。

②沙棗葉提取物具有一定的總還原能力、清除羥自由基、清除DPPH有機自由基能力以及抑制超氧陰離子自由基能力，其清除能力與其濃度呈劑量效應(yīng)關(guān)系。