溫作君，朱冰 ，孫杰，顧隆森

1 安吉縣第三人民醫(yī)院骨科，浙江湖州 313300；2 安吉縣第三人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，浙江湖州 313300

糖尿病是一種高發(fā)的代謝紊亂性疾病，其引起的神經(jīng)、微血管和大血管病變以及免疫反應(yīng)低下可導(dǎo)致創(chuàng)面愈合不良［1］。創(chuàng)面愈合困難經(jīng)常因組織缺血或持續(xù)的壓力而加劇，特別是在足部，如果沒(méi)有得到適當(dāng)?shù)闹委?，最終可導(dǎo)致截肢。研究表明，糖尿病足潰瘍（DFU）的治療成本是非 DFU 的十倍［2］，且DFU 的直接成本和患者 5 年生存率與癌癥相當(dāng)［3］。因此，探索改善糖尿病創(chuàng)面愈合的創(chuàng)新療法有利于減輕該疾病對(duì)患者和社會(huì)的負(fù)擔(dān)。近年越來(lái)越多的證據(jù)表明，干細(xì)胞療法有利于組織再生和創(chuàng)面愈合［4］?，F(xiàn)從干細(xì)胞類型、干細(xì)胞的給藥途徑和干細(xì)胞的操縱技術(shù)三個(gè)方面展開綜述，為干細(xì)胞進(jìn)一步應(yīng)用于臨床治療糖尿病創(chuàng)面提供參考。

1 用于治療糖尿病創(chuàng)面的干細(xì)胞類型

1.1 成體（成人）干細(xì)胞 間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）是最常見的用于治療的體細(xì)胞。MSC 是一種具有自我更新能力的多能干細(xì)胞，存在于骨髓、脂肪組織、臍帶、胎盤和外周血等多種組織器官中［5］。在合適的條件下，MSC 可分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞；也可分化為其他細(xì)胞類型，如內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞和皮膚附屬細(xì)胞。更重要的是，MSC 是營(yíng)養(yǎng)工廠，可產(chǎn)生各種各樣的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、血管生成素-1（Ang-1）和基質(zhì)衍生因子-1（SDF-1）［6］。這些因子有助于不同階段的創(chuàng)面愈合，其中一些因子還具有免疫調(diào)節(jié)功能，如增加抗炎因子IL-10、IL-4水平，降低TNF-α和IFN-γ水平［7］。這些因子還通過(guò)抗菌肽LL-37發(fā)揮抗菌作用，這對(duì)易感染的糖尿病創(chuàng)面非常有益［8］。因此，MSC是組織工程技術(shù)和皮膚再生細(xì)胞療法的理想細(xì)胞。

MSC 具有免疫豁免特性，因此在多個(gè)同種異基因移植人體臨床試驗(yàn)中顯示出良好安全性。隨機(jī)臨床試驗(yàn)的薈萃分析表明，無(wú)論年齡大小或潰瘍大小，自體干細(xì)胞均有助于治愈糖尿病潰瘍［9］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSC）是一種具有轉(zhuǎn)化前景的干細(xì)胞類型，適用于糖尿病創(chuàng)面的同種異體細(xì)胞和自體細(xì)胞治療。目前，BM-MSC 是糖尿病創(chuàng)面臨床前和臨床研究的首選細(xì)胞類型［10］。這可能是由于其臨床轉(zhuǎn)化效果較好和安全性良好。然而，BM-MSC 的分離具有很強(qiáng)的侵襲性，目前正在尋找其他更易獲得的替代來(lái)源，如脂肪、胎盤組織、臍帶。

有趣的是，對(duì)干細(xì)胞治療DFU 的文獻(xiàn)進(jìn)行綜合分析發(fā)現(xiàn)，與臨床前研究相比，臨床研究中使用外周血干細(xì)胞的報(bào)道較多［10］。這種差異表明，更容易獲得的自體成人干細(xì)胞來(lái)源（如血液和脂肪）將更有可能在臨床上應(yīng)用。基質(zhì)血管組分（SVF）是成人基質(zhì)/干細(xì)胞家族的新成員，是從脂肪組織提取出來(lái)的多種細(xì)胞的混合體，包括MSC、內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞（SMC）、周細(xì)胞和脂肪前體細(xì)胞。富含高水平EPC和MSC的SVF有助于新生血管再生。HAN 等［11］研究結(jié)果顯示，SVF 可刺激糖尿病成纖維細(xì)胞的增殖和膠原合成，并縮短治愈時(shí)間，為DFU 提供一個(gè)簡(jiǎn)單和有效的治療方法。最近一項(xiàng)臨床研究表明，SVF可以通過(guò)促進(jìn)血管修復(fù)和血管化方式安全地加速創(chuàng)面愈合［12］。由于SVF較易在手術(shù)室中收集和處理，其可以作為即時(shí)治療方法。此外，SVF 可移植回患者體內(nèi)，避免了昂貴的GMP 實(shí)驗(yàn)室處理。然而，目前SVF 臨床應(yīng)用仍存在困難，包括缺乏標(biāo)準(zhǔn)的提取方案（尤其是在機(jī)械處理和酶處理方面）、膠原酶消化成本高，以及加工過(guò)程中可能存在污染風(fēng)險(xiǎn)。盡管存在這些障礙，SVF作為一種術(shù)中細(xì)胞治療方法，其應(yīng)用前景是光明的。

1.2 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC） 盡管MSC 是一種有希望用于治療目的的細(xì)胞類型，但它們并沒(méi)有無(wú)限增殖能力，這限制了其在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。TAKAHASHI 等［13］于 2006 年成功研發(fā) iPSC，他們將體細(xì)胞重新編程為多能干細(xì)胞，使其具有增殖能力和分化潛力，用于解決成人干細(xì)胞有限的問(wèn)題。成年體細(xì)胞通過(guò)病毒或非病毒遞送系統(tǒng)誘導(dǎo)四種轉(zhuǎn)錄因子（通常為Oct4/Sox2/KLF4/cMyc 或Oct4/Sox2/NANOG/LIN28）的表達(dá)，可重編程為 iPSC。iPSC 最大的優(yōu)點(diǎn)是其無(wú)限分化為各種靶細(xì)胞的能力，可用于創(chuàng)面愈合的治療。此外，應(yīng)用iPSC 還可避免胚胎干細(xì)胞（ESC）面臨的倫理問(wèn)題。

越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)iPSC 具有強(qiáng)大的治療潛力。KASHPUR 等［14］將 iPSC 衍生的成纖維細(xì)胞接種到3D 組織上，發(fā)現(xiàn)其可以長(zhǎng)入糖尿病創(chuàng)面并促進(jìn)創(chuàng)面愈合，表明iPSC 具有治療DFU 的潛力。最近，GORECKA 等［15］發(fā)現(xiàn)，在糖尿病小鼠模型中，將新生兒成纖維細(xì)胞的iPSC 分化為SMC（實(shí)驗(yàn)組）并經(jīng)膠原基質(zhì)進(jìn)行輸送，可加速小鼠創(chuàng)面愈合和創(chuàng)面床的新生血管生成。與對(duì)照組脂肪來(lái)源的MSC（ADSC）相比，實(shí)驗(yàn)組SMC 在植入后7 d 仍存在于創(chuàng)面床上，并分泌更高水平的促血管生成細(xì)胞因子，加速創(chuàng)面閉合。此外，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面區(qū)域促炎癥相關(guān)的M1 型巨噬細(xì)胞數(shù)量減少，促再生作用的M2 型巨噬細(xì)胞數(shù)量增加。ITOH 等［16］將來(lái)源于健康者和隱性營(yíng)養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥患者皮膚的iPSC 誘導(dǎo)分化為功能性真皮成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞，并移植到3D 皮膚模型中用于創(chuàng)面治療［17］。另外一項(xiàng)研究使用人iPSC 分化的SMC 治療下肢缺血模型小鼠，小鼠下肢缺血狀況顯著改善［18］。上述這些研究表明iPSC是治療創(chuàng)面的理想細(xì)胞類型之一。

由于真皮層高度血管化，血液供應(yīng)不良的慢性糖尿病創(chuàng)面使用常規(guī)方法愈合不佳。因此，優(yōu)化創(chuàng)面部位的新生血管生成是另一個(gè)至關(guān)重要的治療目標(biāo)。MSC與內(nèi)皮細(xì)胞或EPC的共培養(yǎng)為快速微血管組裝提供了必要的原材料，進(jìn)而增強(qiáng)血管連接。然而，內(nèi)皮細(xì)胞具有高度的免疫原性，因此不可能僅依賴同種異體來(lái)源的這些細(xì)胞，使用自體iPSC衍生的內(nèi)皮細(xì)胞可以解決這一難題。ABACI等［19］利用iPSC衍生的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合新型3D生物打印技術(shù)成功創(chuàng)建血管網(wǎng)絡(luò)，并在小鼠模型中成功驗(yàn)證。SHEN等［20］使用來(lái)自1型糖尿病患者和健康者的iPSC內(nèi)皮細(xì)胞生成帶血管的皮膚結(jié)構(gòu)，植入后3 d內(nèi)可實(shí)現(xiàn)宿主血管灌注。這種聯(lián)合組織工程技術(shù)有利于制造個(gè)性化的血管化皮膚。

盡管干細(xì)胞療法（包括MSC和iPSC）前景光明，但細(xì)胞表型變異可在不同的個(gè)體間發(fā)生，甚至在同一個(gè)體上發(fā)生，通常難以確定其總體療效。此外，存在一些安全問(wèn)題，如培養(yǎng)過(guò)程中的潛在致突變性以及植入后未分化細(xì)胞的潛在致瘤性。未來(lái)需要進(jìn)一步改進(jìn)體細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù)，以實(shí)現(xiàn)更嚴(yán)格、更可靠的iPSC表型分析。

2 治療糖尿病創(chuàng)面干細(xì)胞的給藥途徑

目前，雖然有一些方法可以將干細(xì)胞運(yùn)送到感興趣的部位，但由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，很難對(duì)比它們的療效。由于糖尿病是全身性疾病，通過(guò)全身或局部注射干細(xì)胞治療糖尿病創(chuàng)面均是有益的。

全身給藥即將干細(xì)胞直接注射到血液循環(huán)中或肌肉中。干細(xì)胞全身給藥有助于緩解糖尿病的一些全身并發(fā)癥，例如使用脂肪來(lái)源的MSC或iPSC-SMC對(duì)肢體缺血進(jìn)行血運(yùn)重建，從而改善整體愈合環(huán)境［18，21］。值得注意的是，在靜脈輸注MSC時(shí)，大部分MSC 被困于肺部，這使得MSC 在給藥后體內(nèi)存留時(shí)間短暫［22］。因此，避免細(xì)胞被困于肺部可能會(huì)提高循環(huán)MSC 的存活率。采用動(dòng)脈注射，如通過(guò)股動(dòng)脈、頸動(dòng)脈、左心室或腎動(dòng)脈，可以避免這個(gè)問(wèn)題［23］。雖然動(dòng)脈給藥有利于MSC 靶向器官，但這種途徑增加了侵襲性和并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。

雖然局部注射干細(xì)胞治療創(chuàng)面較簡(jiǎn)單，但是存在細(xì)胞植入不良情形。一項(xiàng)研究顯示，局部注射BM-MSC 至創(chuàng)面后，第28 天僅檢測(cè)到2.5%的原始細(xì)胞［24］。為了改善植入效果，可在創(chuàng)面部位使用細(xì)胞基質(zhì)載體進(jìn)行局部給藥。包含生物材料的支架一方面將干細(xì)胞輸送到需要再生的區(qū)域，另一方面直接促進(jìn)創(chuàng)面愈合。研究發(fā)現(xiàn)，水凝膠和聚合物支架可誘導(dǎo)和維持MSC 活性，從而促進(jìn)血管生成、免疫調(diào)節(jié)、基質(zhì)重塑和再生細(xì)胞因子的產(chǎn)生［25-26］。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)有助于識(shí)別供體干細(xì)胞的再生潛力，以及通過(guò)使用亞群標(biāo)記物潛在地幫助篩選和減少臨床使用干細(xì)胞的供體變異性。KHONG等［27］研究發(fā)現(xiàn)，與衰老BM-MSC 相比，年輕BM-MSC 含有較高比例的高表達(dá)組織再生相關(guān)基因細(xì)胞，有利于加速創(chuàng)面愈合。此外，使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)可以識(shí)別創(chuàng)面不同空間區(qū)域的基因表達(dá)差異，有利于特異性治療創(chuàng)面，加速創(chuàng)面愈合。因此，利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)輔助局部或全身個(gè)性化治療創(chuàng)面具有廣泛應(yīng)用前景。

3 治療糖尿病創(chuàng)面干細(xì)胞的操縱技術(shù)

通過(guò)干細(xì)胞操縱可以幫助宿主細(xì)胞歸巢至創(chuàng)面部位，主要包括增加循環(huán)干細(xì)胞、增強(qiáng)細(xì)胞與創(chuàng)面部位的結(jié)合、促進(jìn)干細(xì)胞分化為目標(biāo)細(xì)胞以及增加血管生成。到目前為止，促進(jìn)創(chuàng)面的新生血管生成是創(chuàng)面愈合的最重要目標(biāo)，因?yàn)樗谴龠M(jìn)創(chuàng)面愈合過(guò)程的限制因素。以下討論了為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)而在干細(xì)胞操縱方面取得的各種進(jìn)展。

3.1 支架微環(huán)境 支架基質(zhì)可用于操縱干細(xì)胞微環(huán)境，以增強(qiáng)其促再生能力。DASH 等［28］研究發(fā)現(xiàn)，支架膠原纖維密度可通過(guò)調(diào)節(jié)iPSC-SMC 的分泌功能提高細(xì)胞的再生能力。密集的纖維狀膠原可增加促愈合細(xì)胞因子產(chǎn)生，如VEGF、IL-8、IL-10、TGF-β和角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子（KGF），以及增加內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移。應(yīng)用生物活性聚合物對(duì)支架進(jìn)行表面修飾也會(huì)影響干細(xì)胞的行為。例如，添加層粘連蛋白和透明質(zhì)酸可提高細(xì)胞存活率，并促進(jìn)種植細(xì)胞產(chǎn)生VEGF［29］。此外，支架微環(huán)境中的分子間鍵通過(guò)物理作用調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化。例如，MSC 在不同硬度（0.1~25 kPa）的聚丙烯酰胺水凝膠中培養(yǎng)，可分化為神經(jīng)元、成肌細(xì)胞或成骨細(xì)胞；“較軟”基質(zhì)（0.1~1 kPa）有利于分化為神經(jīng)源性細(xì)胞，而“較硬”基質(zhì)（8~17 kPa）有利于分化為肌源性細(xì)胞［30］。納米技術(shù)的最新進(jìn)展也強(qiáng)調(diào)了支架物理性質(zhì)的重要性，例如通過(guò)調(diào)節(jié)孔隙率來(lái)操縱細(xì)胞命運(yùn)，進(jìn)而加速創(chuàng)面愈合［31］。因此，改變基質(zhì)的機(jī)械性質(zhì)有助于植入的干細(xì)胞感知機(jī)械環(huán)境因素，從而促進(jìn)細(xì)胞遷移和分化，加速不同階段創(chuàng)面愈合。

3.2 缺氧預(yù)處理 細(xì)胞缺氧預(yù)處理可增強(qiáng)MSC 促血管生成能力，進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。ROSOVA 等［32］提出細(xì)胞在移植前需進(jìn)行缺氧預(yù)處理細(xì)胞步驟，使細(xì)胞在移植到具有嚴(yán)重缺氧的體內(nèi)環(huán)境時(shí)能夠抵抗凋亡刺激，例如慢性創(chuàng)面或其他損傷部位的缺血組織。MSC 缺氧預(yù)處理的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是保持細(xì)胞干性和多能性，這對(duì)需要組織再生的區(qū)域非常有益。

3.3 基因改造 干細(xì)胞也可以通過(guò)基因改造來(lái)提高其再生和治療潛力。iPSC的使用為進(jìn)一步的基因改造創(chuàng)造了機(jī)會(huì)，以糾正基因缺陷。TEO等［33］提出應(yīng)用ZFN、TALEN、CRISPR 等技術(shù)體外修復(fù)與糖尿病相關(guān)的突變基因序列，然后再移植回糖尿病患者。從基因上糾正老年糖尿病患者的iPSC，去除與糖尿病、衰老相關(guān)的缺陷基因，增強(qiáng)自體細(xì)胞治療效果。SONG 等［34］研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染方式將v-Myc導(dǎo)入人ADSC中，可促進(jìn)VEGF的分泌和體外血管生成。FIERRO等［35］的臨床前研究也證實(shí)，在小鼠下肢缺血模型中，使用慢病毒載體可以安全地對(duì)MSC 進(jìn)行基因改造，以產(chǎn)生高水平的VEGF，促進(jìn)血管生成。

3.4 納米技術(shù) 納米技術(shù)可以增強(qiáng)干細(xì)胞潛能和分化能力。脂肪干細(xì)胞植入至光敏和仿生核殼納米纖維支架后，在光刺激下可分化為表皮角質(zhì)形成細(xì)胞［36］。納米顆粒也可用于將遺傳物質(zhì)輸送到細(xì)胞。YANG等［37］發(fā)明了一種非病毒、可生物降解的聚合物納米顆粒，可將VEGF基因傳遞給MSC和ESC來(lái)源的細(xì)胞；經(jīng)處理的干細(xì)胞顯著增強(qiáng)了VEGF的生成能力、細(xì)胞活力和結(jié)合靶組織的能力。在小鼠下肢缺血模型中進(jìn)一步證實(shí)，經(jīng)生物降解聚合物納米顆粒向MSC轉(zhuǎn)入VEGF基因組的血管密度顯著高于對(duì)照組，同時(shí)肌肉退化和組織纖維化減少。這些結(jié)果表明，基于生物降解聚合物納米顆粒的工程干細(xì)胞是缺血性疾病的有效治療手段，并顯示出治療創(chuàng)面的潛力。

3.5 分泌體組織工程 MSC 通過(guò)分泌一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（分泌體），發(fā)揮旁分泌效應(yīng)，促進(jìn)移植細(xì)胞的治療效果。分泌體由可溶性因子（如細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子）以及不溶性胞外囊泡（EV）組成。最新研究表明，與MSC 相似，iPSC 也通過(guò)旁分泌效應(yīng)促進(jìn)創(chuàng)面愈合，而不是直接的細(xì)胞相互作用。

越來(lái)越多的研究聚焦于如何利用細(xì)胞上清液中的分泌體，尤其是從不溶性EV 分離出的可溶性因子。EV 含有來(lái)源于細(xì)胞的核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，并作為細(xì)胞內(nèi)相互作用的重要介質(zhì)，比可溶性分泌體更重要［38］。局部微環(huán)境可影響EV 的產(chǎn)生，細(xì)胞密度、細(xì)胞年齡、培養(yǎng)系統(tǒng)幾何形狀、缺氧和機(jī)械應(yīng)力等參數(shù)也會(huì)影響EV轉(zhuǎn)運(yùn)和下游治療效果［39］。因此，可在體外已知促進(jìn)創(chuàng)面愈合的微環(huán)境中探索EV。

許多研究表明，不同細(xì)胞來(lái)源的EV 均可通過(guò)促進(jìn)膠原合成和血管生成，進(jìn)而促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合［40-42］。此外，EV 也被作為生物活性分子裝載到組織工程支架上用于創(chuàng)面愈合。TAO 等［43］成功構(gòu)建miR-126-3p 過(guò)表達(dá)滑膜MSC 控釋外泌體復(fù)合殼聚糖基質(zhì)支架，該支架通過(guò)增強(qiáng)再上皮化、血管生成和膠原生成，加速糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合。WANG 等［44］設(shè)計(jì)了一種抗菌多功能FHE 水凝膠（F127/OHAEPL），其可控制釋放來(lái)自ADSC 的外泌體。一項(xiàng)關(guān)于MSC-EV 促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合的臨床前文獻(xiàn)薈萃分析發(fā)現(xiàn)，富含非編碼RNA或微小RNA的EV，對(duì)糖尿病創(chuàng)面的愈合有顯著影響，在血管密度和數(shù)量、疤痕寬度和再上皮化等方面也有積極的改善作用［45］。這些研究結(jié)果有利于推動(dòng)MSC-EV的臨床轉(zhuǎn)化。

與基于細(xì)胞的治療相比，EV的優(yōu)勢(shì)在于能夠良好地修飾治療材料，從而在體內(nèi)產(chǎn)生可預(yù)測(cè)的劑量反應(yīng)效應(yīng)。此外，EV 也可以長(zhǎng)期存儲(chǔ)而不喪失功能。因此，EV是一種非常有潛力的創(chuàng)面治療非細(xì)胞替代品，避免了單獨(dú)使用干細(xì)胞或與干細(xì)胞聯(lián)合使用的潛在并發(fā)癥和風(fēng)險(xiǎn)。

4 總結(jié)與展望

SVF 和iPSC 是治療糖尿病創(chuàng)面的潛在細(xì)胞療法，SVF 具有即時(shí)使用特性，而iPSC 具有倫理問(wèn)題少和來(lái)源豐富的優(yōu)勢(shì)，這使得它們非常適合用于難以治愈的慢性創(chuàng)面和復(fù)雜組織損傷。在給藥途徑方面，全身或局部注射干細(xì)胞治療糖尿病創(chuàng)面均是有效方式，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)有助于干細(xì)胞給藥途徑更加個(gè)性化，加速創(chuàng)面愈合。在干細(xì)胞的操縱技術(shù)方面，多種技術(shù)從不同角度均可操縱干細(xì)胞，直接或間接增強(qiáng)移植細(xì)胞的功能，以促進(jìn)創(chuàng)面愈合。其中，分泌體是一種很有前途的非細(xì)胞治療策略，可以在難以愈合的慢性糖尿病創(chuàng)面中實(shí)現(xiàn)創(chuàng)面愈合，越來(lái)越多的難治性疾病可能受益于此類治療方法。未來(lái)仍需進(jìn)一步研究，解析干細(xì)胞療法的確切機(jī)制，評(píng)估此類療法的臨床安全性，并專注于創(chuàng)新和臨床轉(zhuǎn)化。

利益沖突所有作者聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明溫作君：論文撰寫及文獻(xiàn)資料的收集分析；朱冰：文獻(xiàn)資料的收集，指導(dǎo)寫作；孫杰，顧隆森：論文審核及修正，指導(dǎo)寫作