周國權 黃承俊

（遼寧省農業(yè)發(fā)展服務中心，遼寧沈陽 110032）

體外胚胎生產技術是家畜繁育的核心技術之一。但豬育種中利用該技術的效果不如牛、羊育種,一是因為體外胚胎生產技術常與細管凍精技術相結合,而豬體外胚胎的超低溫冷凍難度較大,進展較為緩慢[1]。豬的鮮精液在低溫下具有較長的受精保存期[2,3],能夠滿足國內任意長距離運輸的需要。而細管凍精不僅各指標都不如鮮精液[4,5],而且在人工授精前還需要解凍并稀釋到一定的精液量[6],推廣難度大。二是因為豬為多胎動物,具有高繁特性。我國多數品種的豬平均窩產仔數都在10頭以上,有些地方品種豬的產仔數甚至達到幾十頭的水平[7],這都是體外胚胎移植難以達到的高度[8],也是豬體外胚胎生產難以發(fā)揮優(yōu)勢的主要原因。此外,體外胚胎生產不僅需要一定的條件和造價,還難以保證移植后仔豬的品質與數量,綜合成本或不低于直接購買。

隨著我國對種質資源普查與保護的推進,作為家畜資源保護與利用的重要技術手段之一,豬體外胚胎生產技術體系的應用也逐漸被重視起來,且已運用于某些地方品種豬的保護與開發(fā)中[9]。此外,我國豬凍精的生產也取得了很大突破[10,11],在一定程度上促進了豬體外胚胎生產體系的成熟。本文從豬卵母細胞的體外成熟、體外受精和胚胎的體外培養(yǎng)等3方面對我國豬體外胚胎生產關鍵技術的發(fā)展現(xiàn)狀進行綜述,以期為相關學者提供參考。

1 豬卵母細胞的體外成熟

卵母細胞的體外成熟是體外胚胎生產體系中相對較為成熟和簡單的技術環(huán)節(jié)。卵母細胞除了用于體外胚胎的生產外,還廣泛用于克隆胚胎、單精注射胚胎和孤雌激活胚胎的研究。尤其豬等多胎類家畜,由于體外胚胎在生產實踐中應用相對較少,該技術環(huán)節(jié)更偏向于研究領域。

1.1 卵巢的運輸條件及卵母細胞的獲取

卵巢是卵母細胞的發(fā)育儲存庫,保護好卵巢即是保護好卵母細胞。卵母細胞的保存條件并不十分嚴格,如距離較近時,可以直接采集并短時間常溫保存,然后帶回實驗室進行處理即可[12,13]。距離稍遠時可用含青鏈霉素的30～37℃的生理鹽水先保存,于1～2 h帶回實驗室進行處理[14,15],且最好不超過6 h。距離再遠就需低溫保存,此外,也有用其他溫度生理鹽水保存運輸的[16,17]。一般卵巢離體后,運回實驗室的時間越短越好。卵巢的保存溫度和運輸時間因實驗室而異,并無嚴格的數值限定。

卵巢運回實驗室后,多數是先去除周圍多余的組織,然后用含青鏈霉素的37℃左右的生理鹽水洗3～4次,最后進行卵母細胞的采集操作。由于豬卵母細胞的采集多采用集中撿卵法,可以無需采卵液,因此,有的實驗室則不經清洗直接進行采卵。方法主要為抽吸法,方便快捷。常用18號針頭的10 mL注射器,對表面直徑為3～8 mm的卵泡進行側吸,然后集中撿卵。

用于體外成熟的卵子一般為具有3層及以上卵丘細胞的卵丘—卵母細胞復合體(COCs)。這與其他家畜類似,因為裸卵(DOs)的成熟率、受精率和囊胚發(fā)育率均極顯著低于COCs[18]。撿出的COCs用成熟液洗滌后即可進行成熟培養(yǎng),一般洗滌次數為3次。

1.2 卵母細胞的體外成熟

常用于豬卵母細胞體外成熟的基礎培養(yǎng)液有TCM199和NCSU-23,其中NCSU-23基礎培養(yǎng)液是豬卵母細胞體外成熟液的專用基礎培養(yǎng)液,效果較好[19]。但也有試驗顯示NCSU-23不如改良后的TCM199或無差異[20,21],加上TCM199市場化較為成熟,因此,國內研究以使用TCM199基礎培養(yǎng)液的較多。成熟培養(yǎng)液在基礎培養(yǎng)液上常添加10%胎牛血清(FBS)、10 IU/mL促卵泡素(FSH)、10 IU/mL促黃體素(LH)、0.6/0.57 mmol/LL-半胱氨酸等,或用10%豬卵泡液代替10%FBS,用10 IU/mL孕馬血清促性腺激素(PMSG)、10 IU/mL人絨毛膜促性腺激素(hCG)代替10 IU/mL FSH和10 IU/mL LH,有條件的還可加上10 ng/mL表皮生長因子(EGF)及其他改良因子等。培養(yǎng)條件基本都是38.5～39℃、飽和濕度、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42～44 h。也有培養(yǎng)46～48 h,甚至更長的,但據賈佩[22]報道培養(yǎng)時間較長其卵裂率和囊胚率均顯著低于40～42 h。一般而言,豬卵母細胞的體外成熟時間應不低于40 h,但也不能太長,否則會增加染色體的異常率。

2 豬成熟卵母細胞的體外受精

體外受精技術主要用于體外胚胎的生產。因其可對精子質量進行直接的檢驗,也常用于各種精子稀釋液、冷凍保存液、種公畜精液等的品質檢測。由于豬的多胎特性及豬體外胚胎移植產仔率顯著低于人工授精的現(xiàn)狀,使得體外胚胎生產在豬的應用推廣上難度較大。因此該技術環(huán)節(jié)常見于實驗室研究、檢驗及少量的良種保護,在科研中常被孤雌激活技術所替代。

2.1 精子的洗滌

精子的洗滌是為獲能做準備,同時去除雜質,篩選出活力較強的有效精子。精子獲能是體外受精的必備前提,獲能的好壞直接關系到體外受精成功與否。因此,精子的洗滌環(huán)節(jié)十分重要。但對于某些特殊對象或試驗研究,精子的獲能環(huán)節(jié)可被單精注射等輔助生殖技術所替代,而精子則仍需進行洗滌。

豬精子的洗滌方法與其他家畜的一樣,有上浮法、直接洗滌法和Percoll密度梯度離心法。運用上浮法時,上浮1 h最有利于受精胚胎的發(fā)育,且受精卵的卵裂率和囊胚率均表現(xiàn)最高[22]。運用Percoll密度梯度離心法時,精子獲能時間在20～40 min較為理想[23]。精子洗滌方法的選擇因人和實驗室條件而異,各有優(yōu)缺點。

洗滌后的精子需對濃度進行調試,以供受精使用。豬體外受精用精子的濃度一般為105～106個/mL。蘭宗寶[24]對0.25×106～8×106個/mL豬精子濃度的體外受精情況做了對比,結果顯示,精子濃度為1×106個/mL時囊胚率表現(xiàn)最高,但該區(qū)間的卵裂率和囊胚率均無顯著性差異。

2.2 豬卵母細胞的體外受精

可用于豬卵母細胞的體外受精溶液有多種,如mTCM199、mTALP、BO液、PGM、mTBM等。其中mTBM因具有較好的受精效果而被各實驗室廣泛采用[25]。受精前,常添加200 ug/mL的肝素以保證精子的充分獲能?；蛱砑右欢康呐Ｑ灏椎鞍?BSA)、BSA+咖啡因等獲能因子來促進精子的獲能。其受精時間為6 h,受精條件為38.5～39℃、飽和濕度、5%二氧化碳培養(yǎng)箱,受精方式為微滴法。體外受精液的選擇因人、實驗室條件和試驗用途而異,但不管使用哪一種,其卵裂率和囊胚率均顯著低于孤雌激活胚。這可能與豬的體外受精多精入卵率相對較高(可達80%)[26]和受精后雄原核形成率相對較低等因素有關。

3 豬胚胎的體外培養(yǎng)

體外培養(yǎng)技術主要用于受精卵、孤雌激活胚、克隆胚、類囊胚等可發(fā)育、短暫發(fā)育胚胎、類胚胎的體外發(fā)育,以生產融合胚、桑囊胚及相關研究。該技術環(huán)節(jié)相對簡單,主要在于培養(yǎng)液的選用和優(yōu)化。

可用于豬胚胎體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基有NCSU-23、NCSU-37、PZM[27]等。但相比之下NCSU-23更有利于豬受精卵的體外發(fā)育,其使用時常添加0.4%的BSA,也可添加其他因子或在培養(yǎng)第5 d后添加10%FBS(或FCS、或PFF)以促進囊胚的發(fā)育[28],不可使用豬血清。有試驗顯示,PZM-3的卵裂率和囊胚率與NCSU-23的差異不明顯,有時還略優(yōu),囊胚細胞總數和內細胞團占囊胚細胞總數的比例均顯著高于NCSU-23[29]。因此,在國內,豬胚胎的體外培養(yǎng)多選用以上2種培養(yǎng)液,一般PZM-3更適合于豬孤雌激活胚胎和克隆胚胎的培養(yǎng)。

豬胚胎的體外發(fā)育會遇到阻滯現(xiàn)象,常發(fā)生在4-細胞階段。除上述培養(yǎng)液外,細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)也能支持豬受精卵的進一步發(fā)育。Nagai等[30]試驗發(fā)現(xiàn),豬2-細胞胚胎與豬輸卵管上皮細胞或豬胚原代成纖維細胞共培養(yǎng)時,囊胚率能分別達到67%和61%。此外,顆粒細胞單層亦能有效提高豬體外受精卵的囊胚發(fā)育率[31,32]。但該技術在國內運用的很少,一方面可能豬的試驗材料相對較為豐富,而運用于胚胎移植的需求相對較少。另一方面可能豬的孤雌激活囊胚率相對較高,程序簡單且穩(wěn)定,干擾因素少,較卵母細胞的體外受精和胚胎的體外培養(yǎng)更具試驗優(yōu)勢。

豬胚胎的體外培養(yǎng)條件與其他家畜的一樣,也是38.5～39℃、飽和濕度、5%二氧化碳培養(yǎng)箱。培養(yǎng)方式為微滴法。觀察時間也基本相同,即48 h后檢查卵裂情況,7 d后檢查桑囊胚的發(fā)育情況。

4 結論

豬的體外胚胎生產各關鍵技術因其多產多胎的特性受到影響,雖然該技術體系在國內已十分成熟,但用途仍集中在試驗研究方面,目前以卵母細胞的體外成熟—孤雌激活—胚胎的體外培養(yǎng)線路為主流。隨著我國種質資源普查與保護的推進,豬體外胚胎保種勢必列入各省地方豬品種保護與利用的關鍵技術之中,應用也將更傾向于生產。本文討論了豬體外胚胎生產各關鍵環(huán)節(jié)技術的發(fā)展現(xiàn)狀,將有助于各地方豬體外胚胎保種體系的建立。