董 浩，黃俊源，何昀桐，冼燕萍，白衛(wèi)東，曾曉房*

（1 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院 廣東省嶺南特色食品科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程創(chuàng)新研究院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部嶺南特色食品綠色加工與智能制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州 510225 2 廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院 食品安全預(yù)警研發(fā)中心 廣州 510447）

雜環(huán)胺（Heterocyclic aromatic amines，HAAs）主要是由含有豐富蛋白的食品在較高溫度及長(zhǎng)時(shí)間的加工過(guò)程中產(chǎn)生的一種潛在的致癌物[1-3]。人體若長(zhǎng)期或過(guò)量攝入，易增加患癌風(fēng)險(xiǎn)[4-5]。近年來(lái)雜環(huán)胺對(duì)人體的危害已成為一個(gè)備受關(guān)注的問(wèn)題[6-7]。雜環(huán)胺分為氨基咪唑氮雜芳烴 （Aminoimidazoazaarenes，AIAs）和氨基咔啉（Amino-carbolines）兩大類(lèi)型[8-10]。7 種常見(jiàn)的氨基咔琳類(lèi)雜環(huán)胺（非極性雜環(huán)胺）化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 7 種非極性雜環(huán)胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structural formula of 7 nonpolar HAAs

廣式燒鵝是廣東的傳統(tǒng)美食之一，其烹飪過(guò)程極易產(chǎn)生雜環(huán)胺，因此，對(duì)其雜環(huán)胺檢測(cè)方法的研究就顯得尤為必要。目前雜環(huán)胺的檢測(cè)方法雖有很多，但都存在一些的缺點(diǎn)和不足[11]。比如：當(dāng)采用氣相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法時(shí)，雜環(huán)胺容易因呈極性和不易揮發(fā)的特性而吸附在色譜柱和進(jìn)樣器上，導(dǎo)致出現(xiàn)峰展寬和拖尾等峰形惡化問(wèn)題，雖然氣相色譜-質(zhì)譜法解決了低濃度雜環(huán)胺不易檢出的問(wèn)題[12]，但是仍需將樣品衍生化，使前處理更加復(fù)雜。液相色譜法是最常見(jiàn)的分析方法，它的缺點(diǎn)是選擇性差，靈敏度低。高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道肼高分辨質(zhì)譜 （HPLC-Q-Orbitrap HRMS）的Orbitrap MS 質(zhì)量分辨率、靈敏度都較好，并且能夠測(cè)定精確的相對(duì)分子質(zhì)量[13]，可以根據(jù)檢測(cè)要求，反復(fù)調(diào)用在全掃描模式下采集的數(shù)據(jù)，經(jīng)依賴(lài)性?huà)呙瑁―ata-dependent scan）可以獲得高質(zhì)量的二級(jí)碎片質(zhì)譜圖，實(shí)現(xiàn)對(duì)未知風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的非定向篩查和對(duì)已知風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的準(zhǔn)確定性，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)低分辨質(zhì)譜方法（液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法）只能測(cè)定已知化合物的局限性。近年來(lái)，食品安全檢測(cè)、蛋白組學(xué)等方面的應(yīng)用研究方興未艾[14-16]。

本文利用HPLC-Q-Orbitrap HRMS 技術(shù)，建立7 種非極性雜環(huán)胺基于正離子模式下的一級(jí)母離子的精確質(zhì)量數(shù)、高質(zhì)量二級(jí)碎片質(zhì)譜圖和保留時(shí)間等相關(guān)數(shù)據(jù)，以及7 種非極性雜環(huán)胺的MS/MS 譜庫(kù)。針對(duì)廣式燒鵝的特性，優(yōu)化樣品提取和凈化等前處理?xiàng)l件，采用HPLC-Q-Orbitrap HRMS 正離子全掃描模式，通過(guò)提取的二級(jí)質(zhì)譜圖，與上述MS/MS 譜庫(kù)比較定性，以一級(jí)質(zhì)譜的精確相對(duì)分子質(zhì)量峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品比較定量，建立廣式燒鵝中非極性雜環(huán)胺的篩查定性及定量檢測(cè)方法。應(yīng)用此檢測(cè)方法，抽取市場(chǎng)上部分廣式燒鵝的不同部位，進(jìn)行非極性雜環(huán)胺的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)存在非極性雜環(huán)胺化合物的暴露風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：7 種非極性雜環(huán)胺的中文名稱(chēng)和英文縮寫(xiě)見(jiàn)表1，購(gòu)自上海ANPEL 公司；乙腈、甲酸、乙酸銨均為色譜純級(jí)，德國(guó)CNW Technologies GmbH。

1.2 主要儀器及設(shè)備

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（該系統(tǒng)包含4 個(gè)主要部分，即自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱以及德國(guó)Thermofisher Scientific 的Orbitrap 高分辨質(zhì)譜）；利用XCalibur 4.0 軟件控制質(zhì)譜儀，以及后期的數(shù)據(jù)處理。色譜柱Thermo Accucore aQ C18（2.1 mm×150 mm，2.6 μm）。MS3 digital 渦旋混合器，艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；KDC-40 低速離心機(jī)，安徽中科中佳儀器有限公司；N-EVAP 112 水浴氮吹儀，Organomation 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品制備 參考文獻(xiàn)[17]的方法配制標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.2 樣品制備 試驗(yàn)所用的燒鵝產(chǎn)品（A～D）全部購(gòu)自廣州當(dāng)?shù)鼐哂幸欢ㄖ鹊娘埖旰蜔D店。分別采集鵝胸、鵝翅、鵝腩、鵝腿4 個(gè)部位，將皮和肉分開(kāi)處理，分別用絞肉機(jī)絞碎，在-18 ℃下貯存待用。

1.3.3 樣品提取 參考文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行樣品提取。

1.3.4 樣品凈化 參考文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行樣品凈化。

1.3.5 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定條件 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定條件參考文獻(xiàn)[17]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件和質(zhì)譜定性、定量分析

7 種非極性雜環(huán)胺在ESI+模式下，均得到[M+H]+的準(zhǔn)分子離子峰；乙腈和甲醇是2 種優(yōu)良的極性有機(jī)溶劑，常用作反相液相色譜的流動(dòng)相，而乙腈的黏度更低，壓力更小，洗脫效率更高；在水相流動(dòng)相中加入乙酸銨和甲酸分別達(dá)到了改善峰形和提高離子化效率的目的[16]；梯度洗脫可以實(shí)現(xiàn)7種目標(biāo)雜環(huán)胺的良好分離。因此經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，優(yōu)化出材料與方法中的色譜條件。根據(jù)獲得的7 種非極性雜環(huán)胺的一級(jí)高分辨質(zhì)譜圖（均為[M+H]+），以及從提取一級(jí)母離子中獲取的提取離子流色譜圖，得到如表1所示結(jié)果。

表1 7 種雜環(huán)胺的保留時(shí)間和準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)測(cè)定數(shù)據(jù)Table 1 Determination data of retention time and accurate mass number of 7 HAAs

另外，試驗(yàn)還得到了7 種非極性雜環(huán)胺的二級(jí)高分辨質(zhì)譜圖（圖2），根據(jù)譜圖中顯示的主要特征碎片，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)。在實(shí)際樣品檢測(cè)中，該標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)可進(jìn)行匹配、檢索，從而達(dá)到篩查的目的，更有利于定性分析的進(jìn)一步確定。同時(shí)，在篩查非靶向雜環(huán)胺時(shí)，利用擁有較高精度的質(zhì)量數(shù)和特征碎片的離子，大大減少了可能的分子式組成數(shù)，從而能夠更好的推測(cè)化合物的分子式或結(jié)構(gòu)，提升篩查效率。通過(guò)進(jìn)一步收集雜環(huán)胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，逐步完善雜環(huán)胺的液質(zhì)質(zhì)譜庫(kù)，為肉制品中雜環(huán)胺的篩查和安全風(fēng)險(xiǎn)水平評(píng)估提供技術(shù)支撐。

圖2 7 種非極性雜環(huán)胺的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrogram of 7 nonpolar HAAs

2.2 提取方法的優(yōu)化

常見(jiàn)的提取溶劑包括乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇[18]。在這些提取溶劑中，乙腈的優(yōu)點(diǎn)是極性范圍大，相對(duì)分子質(zhì)量較小，因而具有較強(qiáng)的組織穿透能力，擁有良好的沉淀效果[18]。

加入堿性溶液能加快樣品的分散速度，使目標(biāo)化合物更充分地被提取[19]。同時(shí)為了有效抑制雜環(huán)胺的電離，調(diào)整了目標(biāo)物在水相-有機(jī)相之間鹽析時(shí)的分配比，提高了其向乙腈層轉(zhuǎn)移的效率。本文考察了不同濃度的NaOH 溶液對(duì)目標(biāo)雜環(huán)胺提取效率的影響。在不同NaOH 濃度下，7 種非極性雜環(huán)胺的提取回收率見(jiàn)圖3a。在堿性條件下，隨著NaOH 濃度的升高，7 種非極性雜環(huán)胺的回收率整體呈上升趨勢(shì)，在1 mol/L 時(shí)的回收率最佳。當(dāng)NaOH 溶液濃度為1 mol/L 時(shí)，在氮吹過(guò)程中，提取溶液并不渾濁，表明油脂提取出的量少，原因可能是NaOH 使部分油脂發(fā)生了皂化水解反應(yīng)，起到了一定的除脂效果。故最終采用1 mol/L的NaOH 溶液搭配乙腈作為提取溶劑。

由于NaCl 鹽析效應(yīng)在固相萃取過(guò)程中對(duì)萃取效率有顯著影響，因此研究了0，1.0，1.5，2.0，3.0 g 的NaCl 添加量對(duì)7 種非極性雜環(huán)胺提取效果的影響，結(jié)果如圖3b 所示?？梢钥闯?，在不添加NaCl 的情況下，雜環(huán)胺AαC、Trp-P-1、Trp-P-2 的回收率較差（＜60%）。當(dāng)NaCl 添加量為1.0 g 時(shí)，雜環(huán)胺的提取回收率均有一定程度提高，而AαC與Trp-P-1 的回收率仍在70%以下；當(dāng)NaCl 添加量增加到1.5 g 時(shí)，7 種雜環(huán)胺的提取回收率均在80%～120%之間。當(dāng)NaCl 添加量繼續(xù)增加時(shí)，對(duì)雜環(huán)胺的提取回收率的變化無(wú)太大影響。因此，為獲得較優(yōu)的雜環(huán)胺提取回收率，最終選擇NaCl 添加量為1.5 g。

圖3 不同NaOH 濃度（a）和不同NaCl 添加量（b）對(duì)7 種非極性雜環(huán)胺提取回收率的影響Fig.3 Effect of different concentration of NaOH solution （a） and different NaCl addition （b） on extraction recoveries of 7 nonpolar HAAs

2.3 凈化條件的優(yōu)化

研究了2 種固相萃取柱 （StrataTM-X-C，60 mg/3 mL；PCX，60 mg/3 mL）和不使用固相萃取柱的情況，進(jìn)行比較和測(cè)試。7 種雜環(huán)胺的提取回收率結(jié)果如圖4a 所示。從圖4a 可以看出，采用StrataTM-X-C 和PCX 凈化，各種非極性雜環(huán)胺均可獲得較好的回收率。StrataTM-X-C 是一種強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱，其鍵合了苯磺酸官能團(tuán)與雜環(huán)胺上的-N+可形成較強(qiáng)的離子鍵，通過(guò)水和甲醇的充分淋洗除雜，Harman、AαC、MeAαC 3 種非極性雜環(huán)胺的回收率優(yōu)于使用PCX 固相萃取柱。綜上，采用StrataTM-X-C 固相萃取柱對(duì)提取溶液進(jìn)行凈化，能提高待測(cè)雜環(huán)的提取回收率。

本文還研究了甲醇-氨水混合洗脫液的體積比對(duì)7 種非極性雜環(huán)胺提取回收率的影響，結(jié)果如圖4b 所示。當(dāng)氨水的體積分?jǐn)?shù)從5%增加到10%時(shí)，大多數(shù)非極性雜環(huán)胺的提取回收率均有一定程度的上升，而當(dāng)氨水的體積分?jǐn)?shù)持續(xù)增加時(shí)，部分雜環(huán)胺的回收率有不同程度的降低。在體積比為90∶10 的甲醇-氨水洗脫液下，雜環(huán)胺的整體回收率最優(yōu)。因此，本研究的固相萃取柱洗脫溶液最終確定甲醇-氨水的體積比為90∶10。

圖4 不同固相萃取柱（a）和洗脫液中甲醇與氨水的體積比（b）對(duì)7 種非極性雜環(huán)胺提取回收率的影響Fig.4 Effects of different solid phase extraction columns （a） and volume ratio of methanol to ammonia （b）in eluent on extraction recoveries of 7 nonpolar HAAs

2.4 方法學(xué)考察

用甲醇將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液連續(xù)稀釋至0.05，0.5，1.0，2.0，5.0，10，20，50，100 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，每個(gè)質(zhì)量濃度測(cè)定3 次，以參考文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行分析，得到線性回歸方程、檢出限和定量限。如表2所示，Trp-P-2 和Phe-p-1 在0.5～100 μg/L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，AαC 在0.1～50 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其余5 種雜環(huán)胺在0.1～100 μg/L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，具有較好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)分布在0.996～0.9997 之間。方法檢出限確定在0.02～0.15 μg/kg 之間，而方法定量限在0.05～0.5 μg/kg 之間，因此說(shuō)明本方法具有良好的線性關(guān)系和較高的靈敏度。

表2 7 種雜環(huán)胺的相關(guān)檢測(cè)數(shù)據(jù)Table 2 Related detection data of 7 HAAs

均勻混合3 種部位的燒鵝肉樣品，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，LOQ 添加水平倍數(shù)為1，2 和10，對(duì)3個(gè)添加水平進(jìn)行6 次平行試驗(yàn)（n=6），選取中間添加水平連續(xù)試驗(yàn)5 d（n=5），外標(biāo)法定量，其回收率和精密度的結(jié)果如表3所示，可以得出7 種極性雜環(huán)胺的回收率在71.3%～111.5%之間，日內(nèi)精密度RSD（n=6）在2.2%～6.8%之間，日間精密度RSD（n=5）在2.9%～5.8%之間，表明本方法的回收率和精密度良好。

表3 雜環(huán)胺的回收率、日內(nèi)和日間精密度Table 3 Recoveries，intra-day precision and inter-day precision of HAAs

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

分別取A、B、C、D 4 家飯店燒鵝的鵝胸、鵝翅、鵝腩、鵝腿的皮和肉，采用本文建立的HPLCQ-Orbitrap HRMS 方法對(duì)廣式燒鵝中的7 種雜環(huán)胺進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖5。從圖5可以看出，廣式燒鵝各個(gè)部位樣品中均能檢測(cè)出HAAs。由圖5可知，HAAs 污染水平順序?yàn)轾Z腩＞鵝腿＞鵝胸＞鵝翅，原因可能與各個(gè)部位的油脂含量不同有關(guān)。由圖5還可知，HAAs 污染水平呈現(xiàn)皮＞肉的現(xiàn)象，原因可能是，鵝皮比鵝肉脂肪含量更多，而且在加工過(guò)程中，皮直接接觸外界高溫更容易產(chǎn)生雜環(huán)胺，因此皮中HAAs 的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于肉。

圖5 廣式燒鵝中不同部位的7 種雜環(huán)胺總含量Fig.5 Total contents of 7 HAAs in different parts of Cantonese roast goose

3 結(jié)論

本文采用高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道肼高分辨質(zhì)譜技術(shù)，建立了廣式燒鵝中7 種非極性HAAs 的檢測(cè)方法。確立了樣品前處理的最優(yōu)方案：樣品中添加1.5 g 的NaCl，用1 mol/L 的NaOH 溶液和乙腈進(jìn)行提取和均質(zhì)后，再使用StartaTM-X-C 固相萃取柱進(jìn)行凈化，最后使用體積比90∶10 的甲醇-氨水作為洗脫液洗脫，最后采用C18 色譜柱對(duì)雜環(huán)胺進(jìn)行分離，以乙腈-1 mol/L 乙酸銨溶液（含0.05%甲酸）為流動(dòng)相，在電噴霧正離子、全掃描和數(shù)據(jù)依賴(lài)性?huà)呙枘Ｊ较聶z測(cè)，以保留時(shí)間、一級(jí)離子質(zhì)量準(zhǔn)確度、二級(jí)碎片與庫(kù)匹配準(zhǔn)確定性，以一級(jí)離子峰面積結(jié)合內(nèi)標(biāo)法定量。7種HAAs 在0.1～100 μg/L 的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，該方法靈敏度高，回收率和精密度良好，適用于在中國(guó)傳統(tǒng)美食廣式燒鵝中7 種HAAs 的篩選和定量檢測(cè)。實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果表明，鵝皮的HAAs 含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于鵝肉，可能由于皮中所含蛋白質(zhì)、油脂等較多所致，符合形成雜環(huán)胺前體物質(zhì)的內(nèi)容物含量。同時(shí)，該方法可以進(jìn)一步應(yīng)用于其它加工肉類(lèi)產(chǎn)品中HAAs 的檢測(cè)，可為肉類(lèi)產(chǎn)品中HAAs 的形成和抑制研究提供方法學(xué)基礎(chǔ)。