孫楊婷，周子陽，劉億鼎，嚴曼琦，張洋清，陳欣雨，孟丹

(嘉興學院 醫(yī)學院，浙江嘉興 314001)

雷公藤多苷(tripterygium glycosides，TG)是由植物雷公藤去皮根部提取的總苷，有“中草藥激素”之譽.[1]作為雷公藤的重要有效成分之一，TG具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用，臨床上常用于治療風濕免疫性疾病且療效顯著.但因其對肝、腎和血液系統(tǒng)等具有毒副作用，臨床應(yīng)用受到一定限制.研究表明，TG對血液系統(tǒng)有顯著毒性，且存在明顯的量-毒和時-毒關(guān)系，不僅具有抑制骨髓造血功能，導致有核細胞生成嚴重減少，粒、紅二系細胞增生受阻，非造血細胞明顯增加等毒副作用，而且可能導致再生障礙性貧血的發(fā)生，并且有效治療量與最小中毒量較接近，治療安全范圍較窄，因此，臨床用藥時常與甘草、地黃和三七等中藥配伍使用，以期起到減毒增效作用.[2-4]

甘草性平、味甘，在中藥中有“國老”之稱.甘草酸(glycyrrhizic acid,GA)是甘草的主要成分，GA可阻止Fas抗體介導的細胞凋亡，促進骨髓造血功能恢復，臨床常用于治療再生障礙性貧血.[5]但是對于GA能否改善TG所致的血液系統(tǒng)毒性，目前尚無相關(guān)研究.因此，本研究擬建立膠原誘導性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠模型，使用臨床治療類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)的常用藥物雷公藤多苷片(tripterygium polyglycosides tablets,TPT)，采用臨床等效劑量口服給藥的方式，并設(shè)立配伍(TG+GA)組，研究GA是否能夠降低TG所致的Wistar大鼠的血液系統(tǒng)毒性，且提高RA治療效果，為臨床減少TG治療所致的血液系統(tǒng)毒副作用提供實驗依據(jù)和用藥參考.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

選用SPF級雌性3周齡Wistar大鼠40只，體質(zhì)量為100±10 g，購于浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司桐鄉(xiāng)分公司，合格證號SCXK(浙)2021-0006，動物飼養(yǎng)于嘉興學院醫(yī)學院動物實驗中心，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行實驗.

1.1.2 藥物與試劑

藥物：雷公藤多苷片(浙江得恩德制藥股份有限公司，國藥準字Z33020422，10 mg)、甘草酸(上海聯(lián)碩生物科技有限公司，CAS號為1405-86-3，規(guī)格5 g).試劑：牛Ⅱ型膠原、0.1%冰醋酸、完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant,CFA)、4%多聚甲醛、10%乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)、10%水合氯醛、OCT(Optimal Cutting Temperature Compound)包埋劑、蘇木素-伊紅染色劑、Giemsa染色液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號為C0131-100，100 mL)、Masson染色液(沈陽萬類生物科技有限公司，貨號為WLA045a，4×10 mL)、白細胞稀釋液、紅細胞稀釋液(安徽弘慈醫(yī)療科技有限公司，100 mL)、0.9%生理鹽水.

1.1.3 儀器

Cell Counter model R1細胞自動計數(shù)儀(日本olympus公司)、CM1950冷凍切片機(德國Leica公司)、Caliper Life Science活體成像儀、正置熒光顯微鏡(日本olympus公司,型號為BX53).

1.2 實驗方法

1.2.1 CIA模型制備和動物分組

將牛Ⅱ型膠原置于0.1%冰醋酸中充分攪拌溶解，濃度為2 g/L，4 ℃避光保存.再將等體積完全弗氏佐劑與膠原溶液混合，冰上充分乳化，制成牛Ⅱ型膠原乳劑.在大鼠左足、尾根部處注射0.3 mL膠原乳劑，初次免疫7天后，于左足處再次注射膠原乳劑0.1 ml加強免疫誘發(fā)炎癥反應(yīng)，建立CIA大鼠模型并進行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分，[6]累積評分大于4即為造模成功，本次實驗成模率75%，符合預(yù)期.將CIA大鼠隨機分為CIA模型組、TG組、配伍(TG+GA)組，同時設(shè)立對照組，每組各8只.

1.2.2 藥物處理

TG組給予雷公藤多苷40 mg/(kg·d)、配伍組[7]給予雷公藤多苷40 mg/(kg·d)配伍甘草酸60 mg/(kg·d)，每日1次，連續(xù)6周；對照組與CIA模型組均給予等量生理鹽水.

1.3 取材與指標檢測

1.3.1 血液指標檢測

給藥后，于第42 d腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠后進行解剖，腹主動脈取血、EDTA-K2抗凝，血液樣本經(jīng)紅細胞稀釋液、白細胞稀釋液處理后置于Cell Counter model R1細胞自動計數(shù)儀，檢測血液中紅細胞、白細胞參數(shù)值.

1.3.2 骨髓造血干細胞檢測

采血完成后，腹主動脈放血處死大鼠，鈍性分離出股骨，用生理鹽水沖洗干凈，斷開股骨干骺端后,以尖頭鑷子小心夾取骨髓放入預(yù)裝有2 ml胎牛血清的試管中，移液槍反復抽吸充分混勻，取上清液制成多份骨髓涂片，放于Giemsa染色顯微鏡下對比觀察各組大鼠成熟紅細胞及骨髓細胞形態(tài)和數(shù)量增減變化情況.

1.3.3 脾臟組織病理學觀察

處死大鼠后，取出脾臟，經(jīng)過多聚甲醛固定、梯度蔗糖脫水、OCT包埋、液氮冷凍，制作8 μm冷凍切片；經(jīng)常規(guī)HE染色(冷凍切片吹干→冷丙酮15 min→蒸餾水5 min→蘇木素2 min→水10 min→1%鹽酸酒精→水10 min→80%酒精→伊紅15 s→5%酒精10 s→95%酒精10 s→無水乙醇Ⅰ1 min→無水乙醇Ⅱ1 min→二甲苯Ⅰ2 min→二甲苯Ⅱ2 min)，中性樹膠封片后在顯微鏡下觀察脾臟組織紅、白髓及病理變化情況.

1.3.4 踝關(guān)節(jié)病理觀察

10%水合氯醛麻醉大鼠后，置于Caliper Life Science活體成像儀拍攝大鼠左后足X線片，處死大鼠后分離取出大鼠后肢，保留完整踝關(guān)節(jié)，4%多聚甲醛固定，10%乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)脫鈣直至關(guān)節(jié)軟化后，OCT包埋制作冷凍切片.踝關(guān)節(jié)組織切片分別進行HE染色與Masson染色(冰凍切片吹干→蒸餾水洗2 min，3次→核染液2 min→蒸餾水3 min→1%鹽酸酒精分化1 s→自來水返藍5 min→漿染液1 min→蒸餾水洗2 min，3次→分色液3 min→復染液5 min→蒸餾水5 min)，中性樹膠封片后在顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨細胞增生變化情況.

1.4 統(tǒng)計學處理

用 SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析檢驗，評判GA配伍對TG所致的血液系統(tǒng)毒性的影響是否顯著，所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示，P≤0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義.

2 結(jié)果

2.1 大鼠外周全血紅、白細胞計數(shù)變化的情況比較

大鼠經(jīng)灌胃給藥6周后，收集腹主動脈血進行血細胞計數(shù)，模型組紅細胞計數(shù)為5.76±0.28(×1012/L)，TG組紅細胞計數(shù)為4.86±0.38(×1012/L)，與模型組比較，TG組紅細胞計數(shù)顯著下降(P<0.05)，表明TG對大鼠血液系統(tǒng)有顯著損害；配伍組紅細胞計數(shù)為7.61±0.94(×1012/L)，白細胞計數(shù)為9.14±1.51(×109/L)，TG組紅細胞計數(shù)為4.86±0.38(×1012/L)，白細胞計數(shù)為4.65±2.48(×109/L)，配伍組與TG組相比，紅細胞計數(shù)及白細胞計數(shù)均顯著增加(P<0.05)，提示GA配伍對TG所致的血液系統(tǒng)毒性起到了一定的減毒保護作用，見表1.

表1 各組大鼠紅、白細胞計數(shù)

鏡下觀察血涂片發(fā)現(xiàn)，TG組視野中紅細胞數(shù)量顯著減少，并可見紅細胞破裂變形，見圖1.

A.對照組；B.模型組；C.配伍組；D.雷公藤組圖1 各組大鼠血涂片(Giemsa染色 ×400)

2.2 大鼠股骨內(nèi)骨髓細胞檢測情況

Giemsa染色后高倍鏡下觀察骨髓涂片，經(jīng)各實驗組組內(nèi)及組間比較發(fā)現(xiàn)，對照組骨髓細胞均勻分布，可見紅系、粒系細胞數(shù)目及形態(tài)正常；CIA模型組骨髓涂片可見明顯成熟紅細胞；而TG組觀察到粒細胞受損變性，成熟紅細胞數(shù)量減少，并出現(xiàn)部分非造血細胞；配伍組較TG組有核細胞增多，可見成熟紅細胞，見圖2.

A.對照組；B.模型組；C.配伍組；D.雷公藤組圖2 各組大鼠骨髓涂片(Giemsa染色×100)

2.3 脾臟組織病理學觀察

HE染色后高倍鏡下觀察，對照組大鼠脾臟結(jié)構(gòu)清晰，紅、白髓分界較明顯，未見充血，動脈周圍淋巴鞘細胞未見增生，脾小體結(jié)構(gòu)清晰；CIA模型組大鼠紅髓增生充血，脾小體結(jié)構(gòu)模糊，動脈周圍淋巴鞘細胞密度較對照組明顯增大，淋巴小結(jié)和淋巴母細胞中心均多于對照組；TG組與配伍組脾臟組織紅髓充血情況均稍有改善，脾臟結(jié)構(gòu)較清晰，但兩組間無顯著差異，見圖3.

A.對照組；B.模型組；C.配伍組；D.雷公藤組圖3 各組大鼠脾臟病理切片 (HE染色 ×100)

2.4 踝關(guān)節(jié)治療情況

灌胃給藥治療6周后，對各實驗組大鼠左后足進行X線成像.X線片顯示，對照組大鼠踝關(guān)節(jié)內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨完整，關(guān)節(jié)面平整未見缺損；CIA模型組大鼠關(guān)節(jié)周圍軟組織腫脹，關(guān)節(jié)面粗糙缺損；TG組及配伍組大鼠踝關(guān)節(jié)周圍未見明顯軟組織腫脹及關(guān)節(jié)面缺損，關(guān)節(jié)面較平整，見圖4.

A.對照組；B.模型組；C.配伍組；D.雷公藤組圖 4 各組大鼠左后足跖X線片

2.5 踝關(guān)節(jié)軟骨病理情況的變化

踝關(guān)節(jié)脫鈣固定包埋后制成冷凍切片，進行HE及Masson染色觀察.HE染色結(jié)果顯示，對照組大鼠踝關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，組織結(jié)構(gòu)正常，軟骨層厚，軟骨細胞排列整齊且數(shù)目較多，滑膜細胞無增生；CIA模型組大鼠踝關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙，軟骨層薄且細胞數(shù)量少，可見明顯炎細胞浸潤，滑膜細胞存在異常增生；TG組與配伍組大鼠踝關(guān)節(jié)軟骨組織較厚，軟骨細胞數(shù)量增多，炎細胞浸潤情況有所改善.比較兩組結(jié)果，配伍組軟骨層厚度更為明顯，炎細胞浸潤相對較少，抗炎效果優(yōu)于TG組，見圖5.

A.對照組；B.模型組；C.配伍組；D.雷公藤組圖5 各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理切片(HE染色 ×200)

Masson染色結(jié)果顯示，對照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨呈均勻藍色著色，向骨關(guān)節(jié)方向著色有所加深，軟骨與軟骨下骨分界清晰；CIA模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙，出現(xiàn)部分染色缺失，軟骨與軟骨下骨分界不清；TG組和配伍組大鼠踝關(guān)節(jié)軟骨染色較均勻，軟骨表面無明顯缺失，軟骨與軟骨下骨分界較明顯，配伍組軟骨結(jié)構(gòu)完整度及軟骨細胞分布情況趨于正常，對軟骨損傷的保護效果優(yōu)于TG 組，見圖6.

A.對照組；B.模型組；C.配伍組；D.雷公藤組圖6 各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理切片(Masson 染色 ×200)

3 討論

實驗結(jié)果顯示，對于雷公藤多苷治療類風濕關(guān)節(jié)炎所致的血液系統(tǒng)毒性，甘草酸在產(chǎn)生明顯的減毒效果的同時，起到了補脾益氣、行血生津的功效，避免CIA大鼠在疾病后期由于脾腎兩虛導致的貧血情況.顯著改善了大鼠的骨髓抑制情況，增加粒系、紅系細胞數(shù)量，提高了血液中紅、白細胞計數(shù)，且均具有統(tǒng)計學意義，這一現(xiàn)象可能與甘草酸抑制了免疫細胞過度激活、減輕對骨髓造血祖細胞的損傷有關(guān)，[7]或由于甘草酸通過促進骨髓間充質(zhì)細胞增殖，誘導其向多潛能細胞轉(zhuǎn)化，[9]改善了藥物所致的骨髓抑制，但GA減輕TG所致血液系統(tǒng)毒性的具體機制仍有待進一步實驗驗證.

同時，本實驗還發(fā)現(xiàn)甘草酸配伍雷公藤多苷能夠提高關(guān)節(jié)炎治療效果，減輕關(guān)節(jié)軟骨炎細胞浸潤、關(guān)節(jié)面破壞及關(guān)節(jié)周圍軟組織腫脹程度.甘草素有緩急止痛、調(diào)和解毒的功效，現(xiàn)代藥理學研究已證明其具有抗炎調(diào)節(jié)免疫、抗菌抗氧化等多方面作用，[8]中醫(yī)認為風寒濕是關(guān)節(jié)炎發(fā)生的重要原因，而甘草有益氣解毒、緩急止痛之功效，能夠祛除濕邪，通過調(diào)節(jié)機體的清濁代謝從而提高關(guān)節(jié)炎的治療效果.根據(jù)現(xiàn)代藥理學分析，這一現(xiàn)象可能與甘草酸通過抑制PI3K/AKT/NF-κB通路、減輕膠原誘導性關(guān)節(jié)炎發(fā)展有關(guān)，[10]或與甘草酸抑制炎癥關(guān)節(jié)組織PGE2生成有關(guān).[11]但對于CIA大鼠脾臟的炎性變化，如紅髓充血腫脹等情況，甘草酸配伍治療較之雷公藤多苷單獨治療并無明顯增益現(xiàn)象，可能與雷公藤類藥物本身就具有導致脾臟充血增大、淋巴細胞壞死這一副作用有關(guān).[12]

根據(jù)目前采用本療法的臨床數(shù)據(jù)顯示，作為類風濕關(guān)節(jié)炎的常用中醫(yī)治療處方，甘草配伍雷公藤復方煎劑有著祛濕活血之功效，可降低患者關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)、提高雙手平均握力，明顯改善臨床癥狀，治療總有效率較單用雷公藤提高10.2%.[13]而本療法在用于治療類風濕關(guān)節(jié)炎合并貧血的患者時，不僅可減輕關(guān)節(jié)腫脹、弊阻不通等類風濕關(guān)節(jié)炎癥狀，還可發(fā)揮益氣補血、補益肝腎等作用，顯著改善并發(fā)于關(guān)節(jié)炎的貧血癥狀.[8]除此之外，甘草酸在治療過程中產(chǎn)生的不良反應(yīng)也極少，在療效顯著的同時用藥副作用小，綜合本實驗結(jié)果與已有臨床治療手段及相關(guān)文獻，可以推論甘草酸作為雷公藤多苷的配伍藥物，在用于臨床治療關(guān)節(jié)炎及防治相關(guān)不良反應(yīng)方面有較大發(fā)展空間.