李佳怡，胡重文，許昕玥，藏佳燁，俞雨霞，朱文靜，孟丹，王吉錫

(嘉興學院 醫(yī)學院，浙江嘉興314001)

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是由自身免疫功能異常引起的慢性疾病，臨床表現(xiàn)為關節(jié)慢性炎癥和破壞，其高致殘率嚴重影響了患者的生活質(zhì)量.[1]近些年，有大量的研究揭示了RA潛在的致病機理，但RA炎癥反應與軟骨細胞中NLRP3/caspase-1的關聯(lián)程度以及RA確切的病因機制尚不明確，[2-4]因此，進一步驗證和揭示RA的發(fā)病機制仍為研究重點.雷公藤作為中國傳統(tǒng)醫(yī)學的常用藥材，《滇南本草》中最早記載其具有“治筋骨疼痛，風寒濕痹，麻木不仁，癱瘓痿軟，濕氣流痰”等功效，常用于治療關節(jié)炎，同時具有活血化瘀、清熱解毒、消腫散結、殺蟲止血等功效.[5]《本草綱目》曰其“功能祛風除濕，活血通絡，消腫止痛，清熱解毒”.因此， TGT是治療關節(jié)炎的“中國首創(chuàng)植物新藥”，至今尚未發(fā)現(xiàn)有其他中藥能取代它在治療RA方面的核心地位.[6-8]但目前TGT治療RA的具體藥效機制尚不清楚，也未見有TGT對RA細胞焦亡通路進行干預、調(diào)控及作用機制的報道.因此，本研究結合臨床用藥TGT，通過建立CIA大鼠模型，對CIA大鼠軟骨及滑膜細胞內(nèi)NLRP3、ASC、caspase-1表達變化情況進行分析，為TGT調(diào)控NLRP3/caspase-1信號通路抑制炎癥治療RA提供借鑒.

1 試驗材料

1.1 藥物與試劑

雷公藤多苷片(浙江得恩德制藥股份有限公司，國藥準字Z33020422，10 mg)；牛II型膠原蛋白(上海聯(lián)碩生物科技有限公司，AS31372)；弗氏完全佐劑FCA(美國Sigma-Aldrich公司，F(xiàn)5881-10ML)；兔來源一抗NLRP3，ASC，caspase-1抗體(沈陽萬類生物科技有限公司)；兔二步法試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司，PV-6001)；DAB顯色液(北京中杉金橋生物技術有限公司，ZLI-9018)；蛋白質(zhì)免疫印跡(WB)常規(guī)試劑(上海碧云天生物科技有限公司).

1.2 儀器

Leica CM1950 冷凍切片機(德國Leica公司)；IVIS Lumina XRMS III小動物活體光學及X光成像儀(美國PerkinElmer公司)；正置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；電泳儀及轉膜儀(美國Bio-Rad公司).

1.3 動物樣品

本實驗采用SPF級雄性Wistar大鼠40只，周齡6～7周，體質(zhì)量(200±20)g，飼養(yǎng)于嘉興學院醫(yī)學院實驗動物中心標準化動物房(相對濕度50%～70%，溫度23～25℃，晝夜各半)，正常喂養(yǎng)，自由飲水，待適應性喂養(yǎng)1周后進行實驗.

2 試驗方法

2.1 篩選及分組

將40只Wistar大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，進行等體積皮內(nèi)注射和足底皮內(nèi)注射混合液(牛II型膠原蛋白和FCA混合)，14 d后經(jīng)X線影像學檢查篩選出30只大鼠，隨機分為正常對照組、CIA模型組、TGT治療組，每組10只.TGT治療組按2倍臨床劑量給藥(40 mg/(kg·d)，每日給藥一次)，對照組、CIA模型組按體重灌等量生理鹽水，連續(xù)灌胃25 d.

2.2 關節(jié)炎癥評分標準

分別在第5、10、15、20、25 d對灌胃的大鼠進行關節(jié)炎指數(shù)評分，并使用游標卡尺測量每只大鼠兩條后肢足趾的厚度變化.采用0～4級關節(jié)評分法：0分——腳爪正常無炎癥；1分——趾關節(jié)輕微發(fā)紅或腫脹；2分——趾關節(jié)和足跖關節(jié)發(fā)紅并腫脹；3分——踝關節(jié)以下整個腳爪全部發(fā)紅并腫脹；4分——踝關節(jié)嚴重發(fā)紅腫脹并有變形跡象.以兩個腳爪評分之和作為每個大鼠的關節(jié)評分，并在小動物成像儀下拍攝大鼠的右足膝關節(jié)圖像.最后，縱向解剖大鼠膝關節(jié)，觀察膝關節(jié)內(nèi)炎癥的破壞情況.

2.3 膝關節(jié)HE染色觀察

取雙側大鼠膝關節(jié)，將右側膝關節(jié)用4%的多聚甲醛固定2 h，10% EDTA-2Na脫鈣30 d，隨后脫水，OCT包埋，液氮速凍，8μm切片，在HE染色顯微鏡下觀察膝關節(jié)滑膜增生、炎性細胞浸潤及關節(jié)軟骨的損壞情況.

2.4 膝關節(jié)軟骨及滑膜細胞NLRP3、ASC及caspase-1免疫組化檢測

取冰凍膝關節(jié)切片，分別用NLRP3、ASC、caspase-1一抗體4 ℃孵育過夜，再由山羊抗兔lgG-HRP多聚體37 ℃下孵育1 h.待DAB溶液顯色，在顯微鏡下觀察軟骨及滑膜細胞NLRP3、ASC、caspase-1的陽性表達情況，并用Image Pro Plus 6.0統(tǒng)計陽性表達的灰度值.

2.5 膝關節(jié)軟骨細胞NLRP3、 ASC及caspase-1蛋白表達水平檢測

采用Western blot法檢測各組大鼠膝關節(jié)軟骨組織中NLRP3、 ASC及caspase-1的蛋白表達水平.制備軟骨組織蛋白樣品，Bradford法測定蛋白濃度，制備 SDS-PAGE凝膠，上樣、電泳、轉膜、封閉1 h，PBST洗膜10 min×3次，加入一抗(NLRP3、caspase-1、ASC、GAPDH抗體)4 ℃孵育過夜；次日回收一抗，PBST洗膜10 min×3次，再加入HRP標記的二抗(1∶5000)室溫孵育1.5 h，充分洗膜后，加入顯色液顯色，曝光，保存圖片，以GAPDH抗體為內(nèi)參，運用Image J軟件進行定量分析.

2.6 數(shù)據(jù)處理

運用SPSS 16.0軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示，使用單因素方差分析(ANOVA)比較3組間的差異，事后檢驗選用LSD法，P<0.05時認為組間差異具有統(tǒng)計學意義.

3 結果

3.1 各組大鼠關節(jié)炎指數(shù)評分比較

3.1.1 大鼠足趾形態(tài)變化情況

A.對照組；B.模型組；C.治療組圖1 大鼠右足底部形態(tài)變化情況

與對照組比較，模型組大鼠足部軟組織腫脹程度明顯，治療組稍緩解，見圖1.從足趾的厚度變化來看，第5 d開始，模型組相比對照組足趾明顯增厚(**P<0.01);第10 d開始，治療組比模型組足趾厚度明顯降低(##P<0.01)，見表1.

表1 大鼠足趾厚度測量值變化

3.1.2 各組大鼠關節(jié)炎指數(shù)變化情況

模型組與對照組比較， **P<0.01;治療組與模型組比較，##P<0.01圖2 各組大鼠關節(jié)炎指數(shù)變化情況

由圖2可知，從第5 d開始，模型組相比對照組大鼠的關節(jié)炎指數(shù)逐漸升高，差異有統(tǒng)計學意義(**P<0.01)，而治療組相比模型組則逐漸降低，第20 d差異具有統(tǒng)計學意義(##P<0.01).

3.1.3 膝關節(jié)剖面觀察

由圖3可知，對照組大鼠膝關節(jié)剖面正常，關節(jié)面光滑，未見軟骨破壞及滑膜增生；模型組大鼠膝關節(jié)剖面見明顯滑膜增生、軟骨有破壞，可見周圍軟組織腫脹；治療組可見周圍軟組織輕度腫脹，而滑膜及軟骨損傷不顯著.

A.對照組；B.模型組； C.治療組圖3 大鼠膝關節(jié)剖片病理改變情況

3.2 各組間大鼠右足X-ray形態(tài)和膝關節(jié)HE染色對比

3.2.1 大鼠右足趾關節(jié)X-ray形態(tài)

由圖4可知，對照組大鼠關節(jié)周圍軟組織正常，關節(jié)間隙正常，關節(jié)軟骨完整光滑；模型組大鼠關節(jié)周圍軟組織梭形腫脹，關節(jié)間隙變窄，關節(jié)軟骨端邊緣可見輕度侵蝕破壞，鄰近骨骼骨密度降低；治療組大鼠關節(jié)周圍軟組織腫脹程度較輕，關節(jié)骨端邊緣可見輕度侵蝕破壞.

A.對照組；B.模型組； C.治療組圖 4 大鼠右足X-ray照片

3.2.2 大鼠膝關節(jié)軟骨HE染色結果

由圖5可知，對照組大鼠膝關節(jié)軟骨無破壞，軟骨組織正常，細胞排列整齊，無增生，無充血水腫；模型組大鼠顯示軟骨膜變薄，軟骨厚度減小，軟骨細胞增生，層次增多，排列紊亂；治療組大鼠軟骨增生明顯減輕，排列相對規(guī)則.

A.對照組；B.模型組； C.治療組圖 5 大鼠膝關節(jié)軟骨細胞HE染色切片

3.2.3 大鼠膝關節(jié)滑膜HE染色結果

由圖6可知，對照組大鼠膝關節(jié)滑膜組織正常，無纖維增生及充血水腫，淋巴細胞、單核細胞等未見明顯增多、浸潤；模型組大鼠顯示滑膜纖維細胞增生、層次增多、排列紊亂，可見炎性細胞浸潤；治療組大鼠滑膜增生明顯減輕，僅有輕度水腫，排列相對規(guī)則.

A.對照組；B.模型組； C.治療組圖 6 大鼠膝關節(jié)滑膜細胞HE染色切片

3.3 免疫組化測定結果

3.3.1 大鼠膝關節(jié)及滑膜組織NLRP3蛋白含量變化

免疫組化測定結果顯示，對照組軟骨組織內(nèi)存在少量NLRP3陽性染色，模型組大鼠軟骨組織內(nèi)可見較多NLRP3強陽性染色，且灰度值升高明顯(**P<0.01)；而在滑膜組織中NLRP3表達差異更加顯著，模型組大鼠相比對照組灰度值顯著升高(**P<0.01)，治療組大鼠相比模型組灰度值顯著降低(##P<0.01)，見圖7.

A.對照組軟骨；B.模型組軟骨； C.治療組軟骨； D.對照組滑膜； E.模型組滑膜； F.治療組滑膜圖 7 雷公藤多苷片對CIA大鼠膝關節(jié)軟骨及滑膜NLRP3蛋白的影響

3.3.2 大鼠膝關節(jié)及滑膜組織caspase-1蛋白含量變化

免疫組化測定結果顯示，對照組大鼠軟骨及滑膜組織內(nèi)存在少量caspase-1陽性染色(棕褐色)；模型組大鼠相比對照組，其軟骨組織內(nèi)可見較多caspase-1強陽性染色，且灰度值升高明顯(*P<0.05)；治療組大鼠相比模型組，其軟骨組織caspase-1陽性表達明顯減少、灰度值降低更顯著(##P<0.01)，而在滑膜組織中，三者的表達差異不顯著，見圖8.

A.對照組軟骨；B.模型組軟骨； C.治療組軟骨； D.對照組滑膜； E.模型組滑膜； F.治療組滑膜圖 8 雷公藤多苷片對CIA大鼠膝關節(jié)軟骨及滑膜caspase-1蛋白的影響

3.3.3 大鼠膝關節(jié)及滑膜組織ASC蛋白含量變化

免疫組化測定結果顯示，對照組軟骨及滑膜組織內(nèi)存在少量ASC陽性染色(棕褐色)；模型組大鼠軟骨組織內(nèi)可見較多ASC強陽性染色，其灰度值相比對照組有所升高(*P<0.05)，同時滑膜組織內(nèi)陽性表達增加，灰度值顯著升高(**P<0.01)；與模型組相比，治療組軟骨細胞ASC陽性表達明顯減少、灰度值降低顯著(##P<0.01)，滑膜細胞ASC陽性表達明顯減少、灰度值降低顯著(##P<0.01)，見圖9.

A.對照組軟骨；B.模型組軟骨； C.治療組軟骨； D.對照組滑膜； E.模型組滑膜； F.治療組滑膜圖9 雷公藤多苷片對CIA大鼠膝關節(jié)軟骨及滑膜ASC蛋白的影響

3.4 Western blot測定結果

通過Western blot法對細胞中的NLRP3進行檢測，與對照組相比，模型組NLRP3表達升高；與模型組相比，治療組表達降低；其差異均不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05),但蛋白含量表達差異符合分組變化趨勢.測定結果顯示，各實驗組caspase-1表達無明顯變化.與對照組相比，模型組ASC蛋白呈減少趨勢，與模型組相比，治療組ASC呈下降趨勢，但二者均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖10.

圖10 雷公藤多苷片對CIA大鼠膝關節(jié)軟骨及滑膜NLRP3、caspase-1、ASC蛋白含量的影響

4 結語

研究發(fā)現(xiàn)，RA的發(fā)病機制與細胞的焦亡存在很強的相關性，[9-10]而NLRP3/caspase-1近來被證實與細胞焦亡的發(fā)生、發(fā)展有較大的聯(lián)系，該過程發(fā)生的最主要變化就是NLRP3通路中caspase-1蛋白的激活以及炎性因子的成熟釋放，[11-12]本研究也證實了上述結論.另外，本文利用雷公藤清熱利濕解毒的功效對大鼠足趾關節(jié)進行了觀察發(fā)現(xiàn)，治療組CIA大鼠足趾關節(jié)狀態(tài)明顯改善，膝關節(jié)軟骨破壞顯著減輕，這與相關臨床觀察一致，[13-17]也印證TGT能明顯改善RA的臨床癥狀，是臨床治療RA的有效藥物.結合研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制NLRP3的調(diào)控，對RA可起到保護作用.[18]因此， TGT對NLRP3炎性體軸路徑相關蛋白的異常表達均有明顯的調(diào)控作用，可明顯下調(diào)NLRP3、ASC、caspase-1等蛋白的表達.故可以推測TGT治療RA的機制與調(diào)控NLRP3炎性體軸及相關蛋白的表達密切相關，即TGT可以通過下調(diào)炎癥因子的表達來緩解RA的進程，Western blot實驗結果也進一步驗證了TGT是通過調(diào)控NLRP3/caspase-1信號通路來改善RA癥狀.

綜上所述，細胞焦亡中NLRP3/caspase-1信號通路與RA的發(fā)生具有很強的相關性，TGT可以通過調(diào)控NLRP3/caspase-1信號通路，尤其是NLRP3蛋白的表達，可抑制軟骨及滑膜細胞的焦亡，從而緩解RA的發(fā)展進程.但其他通路及其下游蛋白GSDMD的反饋以及TGT劑量變化對NLRP3/caspase-1信號通路的具體影響，仍值得我們繼續(xù)探索.