張偉 黃從新

人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSCs）已經(jīng)成為一個(gè)具有巨大吸引力的種子細(xì)胞，它能克服疾病建模和藥物研發(fā)中動物模型存在的一些局限性[1]?；颊咛禺愋缘膆iPSCs具有自我更新和多向分化的潛能，能夠提供各種疾病相關(guān)的成體細(xì)胞，這為以前無法獲得的細(xì)胞類型（如心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞）提供了豐富的來源。短QT 綜合征（SQTS）是一種由單基因突變引起的遺傳性心律失常，以室性快速心律失常及患者心臟常無結(jié)構(gòu)性改變?yōu)樘卣?，可?dǎo)致暈厥和心源性猝死，是造成年輕人（尤其是嬰幼兒）心源性猝死的主要原因之一。SQTS的患病率較低，成人約0.02%～0.1%，兒童約0.05%[2—3]，以男性為主，其特征是校正的QT 間期（QTc）縮短并伴有較高的心臟猝死風(fēng)險(xiǎn)。目前為止，已經(jīng)報(bào)道了與不同基因突變有關(guān)的8種類型的SQTS[4]。已有多項(xiàng)研究表明，hiPSCs來源的心肌細(xì)胞（hiPSC-CMs）可以在細(xì)胞、組織水平上有效地模擬SQTS，并利用SQTS患者來源的hiPSC-CMs篩選治療SQTS 的潛在藥物。

1 hiPSCs及(hiPSC-CMs)

hiPSCs的出現(xiàn)革新了干細(xì)胞領(lǐng)域的研究，這類細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞相似，理論上具有無限增殖和分化為任何特定細(xì)胞類型的潛能，但與胚胎干細(xì)胞不同的是，hiPSCs是由體細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞、血細(xì)胞等）經(jīng)一系列轉(zhuǎn)錄因子（OCT3/4、SOX2、KLF4、c-MYC 或OCT3/4、SOX2、NANOG、LIN18等）重編程產(chǎn)生的[1，5—7]，這避免了醫(yī)學(xué)倫理上的爭議；hiPSCs為發(fā)病機(jī)制和藥物篩選的研究提供了患者來源的種子細(xì)胞，并為實(shí)驗(yàn)性移植治療提供了豐富的細(xì)胞來源，這將極大促進(jìn)個(gè)性化醫(yī)療和精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展。

經(jīng)十余年的發(fā)展，hiPSCs可通過不同的分化方案向心肌細(xì)胞定向分化[8]?；颊咛禺愋詇iPSC-CMs提供了一個(gè)新的以人源性心肌細(xì)胞為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)平臺，以概括人類心肌細(xì)胞生物學(xué)的關(guān)鍵特征。研究表明，不同患者來源的hiPSCs具有相同的分子、電生理、代謝特征以及心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，但表現(xiàn)出的功能特征更類似于胎兒心肌細(xì)胞，尚處于不成熟狀態(tài)[9]。

hiPSC-CMs表達(dá)心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物，具有心肌細(xì)胞典型的動作電位特征，并能對兒茶酚胺類和膽堿類藥物產(chǎn)生反應(yīng)；根據(jù)心肌細(xì)胞亞型的特性標(biāo)志物及動作電位的形態(tài)，可將hiPSCs-CMs分為心室肌樣細(xì)胞、心房肌樣細(xì)胞以及竇房結(jié)樣細(xì)胞[10]。由于hiPSC-CMs可來源于患者，因此hiPSC-CMs已成為構(gòu)建遺傳性心臟?。ㄈ鏢QTS）模型的熱點(diǎn)種子細(xì)胞[11]。目前誘導(dǎo)hiPSCs向hiPSC-CMs分化的不同方案產(chǎn)生心肌細(xì)胞的比例存在一定的差異，進(jìn)而導(dǎo)致心肌細(xì)胞亞型的差異，因此在利用hiPSCs-CMs研究心臟疾病時(shí)應(yīng)考慮細(xì)胞異質(zhì)性。

2 細(xì)胞水平上構(gòu)建SQTS模型

2018年El-Battrawy等[12]首次利用hiPSCs建立SQTS細(xì)胞模型。該研究小組招募了1例SQTS 1型（SQTS1）患者（基因KCNH2攜帶N588K 突變）和2例健康者，并將皮膚來源的成纖維細(xì)胞重編程為hiPSCs；采用單層細(xì)胞培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)hiPSCs定向分化為hiPSC-CMs，隨后對其進(jìn)行病理生理及藥理學(xué)研究。研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組來源的hiPSC-CMs相比，SQTS1患者來源的hiPSC-CMs的快速延遲整流鉀通道電流（IKr）密度增加，而動作電位時(shí)程（APD）縮短，而且表現(xiàn)出異常的鈣瞬變和節(jié)律性活動?？ò湍憠A能增加SQTS1-hiPSCs-CMs發(fā)生心律失常的風(fēng)險(xiǎn)，奎尼丁可以延長APD 和消除卡巴膽堿對SQTS1-hiPSCs-CMs的致心律失常作用?；蚣暗鞍妆磉_(dá)譜分析，SQTS1-hiPSCs-CMs中基因KCNH2和HERG 通道蛋白表達(dá)上調(diào)。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)通過插入或修正突變基因可以產(chǎn)生具有相同遺傳組成的hiPSCs細(xì)胞系，極大地促進(jìn)了基因疾病的研究[13]。Guo 等[14]將hiPSCs 和CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)有機(jī)整合在一起，在細(xì)胞水平上研究SQTS患者的病理機(jī)制。該團(tuán)隊(duì)招募3例志愿者，包括1例SQTS1患者（基因KCNH2攜帶T618I錯(cuò)義突變）和2例健康成年人；并將這3 例志愿者的皮膚成纖維細(xì)胞重編程為hiPSCs，隨后利用CRISPR/Cas9技術(shù)將SQTS1患者的hiPSCs中KCNH2基因的T618I突變修正，依此作為具有相同遺傳背景的對照組（GC-iPSCs）。所有的hiPSCs通過單層細(xì)胞培養(yǎng)方案被誘導(dǎo)分化為hiPSC-CMs。采用膜片鉗技術(shù)進(jìn)行電生理研究表明，與正常對照組（Con-iPSC-CMs）和GCiPSC-CMs相比，SQTS1-hiPSC-CMs表現(xiàn)為APD 縮短和節(jié)律紊亂；而且SQTS1-iPSC-CMs的IKr密度增加，KCNH2的膜蛋白表達(dá)也明顯增加，這與IKr密度增加的表現(xiàn)是相符的，在單細(xì)胞水平再現(xiàn)了SQTS的表型。在藥物檢測中發(fā)現(xiàn)，奎尼丁干預(yù)顯著延長了SQTS患者（攜帶KCNH2 基因T618I突變）的QTc間期，降低了T 波波幅。在細(xì)胞水平，奎尼丁有效地恢復(fù)SQTS-hiPSC-CMs中的APD，突出了患者特異性hiPSC-CMs在體外實(shí)驗(yàn)中再現(xiàn)藥物治療效果的能力。此外，該研究團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)，Bm KKx2 可通過靶向抑制KCNH2通道進(jìn)而延長APD，這些結(jié)果表明，Bm KKx2等多肽毒素可作為未來發(fā)現(xiàn)治療SQTS藥物的先導(dǎo)化合物。這些研究表明，患者特異性和GC-iPSC-CMs能夠再現(xiàn)SQTS的單細(xì)胞表型。這些發(fā)現(xiàn)將有助于闡明SQTS的機(jī)制，并發(fā)現(xiàn)以肽毒素為先導(dǎo)化合物治療該疾病的治療藥物。

3 SQTS-hiPSCs-CMs在藥物檢測中的應(yīng)用

目前奎尼丁被證明是治療SQTS1 患者唯一有效的藥物，但是臨床用藥發(fā)現(xiàn)，奎尼丁具有較為嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng)。Zhao等[15]利用來自SQTS1患者的hiPSC-CMs檢測伊伐布雷定、阿嗎靈、美西律、氟卡尼、雷諾嗪、胺碘酮對動作電位（AP）的影響和心律失常事件的發(fā)生，以尋找治療SQTS1患者的潛在有效藥物。他們采用膜片鉗技術(shù)和單細(xì)胞收縮測量來評估藥物效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，伊伐布雷定、美西律、阿嗎靈可以延長SQTS1-hiPSCs-CMs的AP，其潛在機(jī)制可能是這些藥物能夠明顯抑制KCNH2通道，進(jìn)而使IKr電流密度降低；此外，伊伐布雷定、美西律、阿嗎靈還可減少腎上腺素誘發(fā)的心律失常；而氟卡尼、雷諾嗪以及胺碘酮卻沒有此類作用[15]。但該研究僅使用了1 例SQTS1 患者的hiPSCs-CMs，其顯示的藥物效應(yīng)還需在更多不同SQTS1患者來源的hiPSCs-CMs進(jìn)行驗(yàn)證。

丙吡胺可延長QTc間期，并可通過阻滯鉀通道標(biāo)準(zhǔn)化QTc[16]。Lan等[17]首次以SQTS1 患者（HERG 通道攜帶N588K 突變）的hiPSC-CMs 為模型，探究了丙吡胺延長APD 和抗心律失常作用的離子機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，丙吡胺能夠延長SQTS1-hiPSCs-CMs的APD 并能減少自發(fā)搏動的SQTS1-hiPSCs-CMs經(jīng)卡巴膽堿和腎上腺素干預(yù)后心律失常事件的發(fā)生，其可能機(jī)制是，丙吡胺通過增強(qiáng)內(nèi)向L 型鈣電流（ICa-L）、晚鈉電流、鈉鈣交換電流（INCX）并抑制外向小電導(dǎo)鈣活化鉀通道電流（ISK），進(jìn)而改善SQTS1-hiPSCs-CMs的APD，但丙吡胺對快速和緩慢激活的延遲整流鉀通道電流和ATP敏感型鉀通道電流無影響。在正常對照組的hiPSC-CMs中，丙吡胺抑制峰鈉電流、ICa-L、IKr以及ISK，同時(shí)能夠增強(qiáng)晚鈉電流和INCX。這些結(jié)果表明，丙吡胺可有效預(yù)防HERG 通道攜帶N588K 突變的SQTS1患者的快速心律失常。

Huang等[18]使用健康者和SQTS1 患者（攜帶N588K突變）的hiPSC-CMs檢測藥物對h ERG 通道門控動力學(xué)的影響。研究結(jié)果顯示，與健康者來源的hiPSC-CMs相比，阿嗎靈、胺碘酮、伊伐布雷定、氟卡尼、奎尼丁、美西律和雷諾嗪對來自SQTS1患者來源的hiPSC-CMs的HERG 通道電流（IKr）的抑制程度較低?？岫『兔牢髀赡軠p少SQTS-hiPSC-CMs和健康者h(yuǎn)iPSC-CMs的IKr達(dá)到峰值的時(shí)間，但阿瑪林、胺碘酮、伊伐布雷定和雷諾嗪產(chǎn)生了相反的效應(yīng)。由于激活或失活曲線的移動可能會改變窗口電流，因此評估了同一細(xì)胞在無藥物和有藥物情況下的IKr窗口電流。在SQTS1-hiPSC-CMs中，奎尼丁、伊伐布定、阿嗎靈和美西律降低了IKr窗口電流，但胺碘酮、氟卡尼和雷諾嗪未能降低IKr窗口電流。這些研究結(jié)果提示，窗口電流減少和失活減緩效應(yīng)可能是藥物在HERG 突變的SQTS1患者發(fā)揮抗心律失常作用的主要機(jī)制，這些發(fā)現(xiàn)可能有助于我們尋找治療SQTS1患者的潛在候選藥物。以上研究提示，SQTS患者來源的hiPSC-CMs可為患者選擇有效藥物提供良好的體外模擬平臺。

4 組織水平上構(gòu)建SQTS模型

對遺傳性心律失常的研究大多集中于hiPSC-CMs的細(xì)胞特性，即動作電位特性和離子電流分布。研究更復(fù)雜的電生理現(xiàn)象，如傳導(dǎo)和折返在心律失常綜合征（如SQTS），則需要發(fā)展多細(xì)胞的組織模型，近年來有學(xué)者致力于構(gòu)建能夠更準(zhǔn)確概括組織和器官水平疾病病理生理特征的SQTS模型[19]。Shinnawi等[20]首次報(bào)道整合患者的hiPSC-CMs、CRISPR/Cas9基因組編輯和組織工程技術(shù)作為工具研究SQTS。該團(tuán)隊(duì)利用的hiPSCs來源于有3代心臟猝死家族史的SQTS患者，基因檢測發(fā)現(xiàn)，該患者KCNH2基因編碼的HERG 通道存在雜合錯(cuò)義突變（N588K）。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，將該患者來源的hiPSCs系中的突變修正，以建立相同遺傳背景的對照組，然后在細(xì)胞水平上檢查hiPSC-CMs的電生理特性。全細(xì)胞膜片鉗記錄顯示，與糾正或健康系相比，SQTS-hiPSC-CMs的APD 明顯縮短。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，通道蛋白表達(dá)增加和失活減弱導(dǎo)致IKr電流增強(qiáng)，這與其他學(xué)者[12，14]的在細(xì)胞水平上的研究結(jié)果是一致的。作者將hiPSCs-CMs作為大型（5 mm）心肌細(xì)胞片植入三維模具結(jié)構(gòu)中；這種簡單的類組織結(jié)構(gòu)（SQTS-hiPSCCCSs）使細(xì)胞形成功能合胞體，并能均勻增殖。光學(xué)標(biāo)測（optical mapping）顯示SQTS-hiPSC-CCSs的APD 明顯縮短，但與正常組相比，傳導(dǎo)速率無明顯改變；SQTS-hiPSCCCSs經(jīng)程序性電刺激后發(fā)生折返性心律失常的敏感性增加，與SQTS患者心室顫動誘發(fā)性增加一致；并在該模型上證實(shí)奎尼丁和二吡嗪通過延長APD 發(fā)揮抗心律失常作用。該項(xiàng)研究表明，使用患者特異性hiPSC-CMs在細(xì)胞和組織水平上再現(xiàn)SQTS疾病表型的能力，并為SQTS患者心律失常的起始、持續(xù)和治療提供新的見解，以及為藥物研發(fā)和測試提供獨(dú)特的實(shí)驗(yàn)平臺。

5 結(jié)語

hiPSCs具有無限增殖和多向分化的潛能，據(jù)此分化獲得的hiPSC-CMs 可以模擬多種心血管疾病模型，結(jié)合CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)也極大地促進(jìn)了hiPSC-CMs在SQTS等多種遺傳性心臟病中的應(yīng)用，為SQTS的遺傳病理生理機(jī)制探討以及潛在治療藥物的檢測提供了很好的研究平臺。