賀瀟瑾，李 丹，周 青，歐陽靜， 田玉球，譚英征

研究發(fā)現(xiàn)，HBV X基因編碼蛋白(HBx)是一個具有多效性的轉(zhuǎn)錄激活因子[1,2]，其在乙型肝炎相關(guān)肝細(xì)胞癌(HCC)發(fā)生發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用[3]。細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子-1(suppressor of cytokine signaling-1，SOCS-1)是細(xì)胞因子受體和Toll樣受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的負(fù)反饋調(diào)控因子，被認(rèn)為是一種抑癌基因，參與了體內(nèi)許多炎癥和免疫反應(yīng)、激素調(diào)節(jié)和多種腫瘤的形成[4]。SOCS-1基因甲基化所導(dǎo)致的基因表達減少在多種腫瘤的形成和發(fā)展過程中起重要作用。大約65% HCC原發(fā)腫瘤外顯子2表現(xiàn)出異常的SOCS-1基因甲基化，而恢復(fù)SOCS-1表達可以抑制癌細(xì)胞生長和導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡[5]。DNA甲基化作為一種以DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)介導(dǎo)的可逆的化學(xué)修飾，可以導(dǎo)致抑癌基因啟動子區(qū)域高甲基化，實現(xiàn)基因沉默，使細(xì)胞周期失控而發(fā)生癌變[6]。DNMT3A和DNMT3B作為新生的甲基轉(zhuǎn)移酶，主要是確保準(zhǔn)確的DNA甲基化模式的產(chǎn)生，與DNA甲基化有密切的關(guān)系[7]。本研究探討了HBx是否通過調(diào)節(jié)DNMTs誘導(dǎo)抑癌基因SOCS-1基因下調(diào)，以進一步探討HBx致HCC發(fā)生的分子機制，為乙型肝炎相關(guān)HCC的預(yù)防和治療決策提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 2019年6月～2021 年6月我院手術(shù)切除的22例新鮮乙型肝炎相關(guān)HCC及其癌旁組織(距離腫瘤邊緣≥5 cm)標(biāo)本。表達HBV-X基因的重組質(zhì)粒pcDNA-X和空質(zhì)粒pcDNA3.0為湖南省病毒性肝炎重點實驗室構(gòu)建。人正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞株購于上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫。Lipofectamine 2000和G418(Invitrogen公司)，CCK8試劑盒(Invitrogen公司)，5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-c，Sigma公司)，總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒(TAKARA公司)，兔抗人SOCS-1多克隆抗體、兔抗人DNMT3A多克隆抗體、鼠抗人DNMT3B單克隆抗體(Abcam公司)，小鼠抗HBx單克隆抗體(上海復(fù)旦大學(xué))，鼠抗人β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠和羊抗兔二抗(CMCTAG公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 取L02細(xì)胞，培養(yǎng)于含5%青霉素和鏈霉素的1640培養(yǎng)基，加入10%胎牛血清，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的L02細(xì)胞，以3×105個/ml密度接種于6孔板。用無血清1640培養(yǎng)基分別稀釋Lipofeetamine 2000脂質(zhì)體、pcDNA-X重組質(zhì)粒或pcDNA3.0空質(zhì)粒，室溫孵育5 min。在轉(zhuǎn)染組，每孔分別加入脂質(zhì)體與質(zhì)粒混合物250 μl，在空白組，加入培養(yǎng)基250 μl，輕輕混勻。培養(yǎng)24 h后，更換新鮮完全培養(yǎng)基，各孔加入200 μg/ml的篩選抗生素G418，繼續(xù)培養(yǎng)至對照組細(xì)胞大部分死亡后逐漸降低藥物濃度，最終以50 μg/ml 的G418維持培養(yǎng)至篩選克隆，即成功篩選出實驗所需的穩(wěn)定表達HBV-X基因的pcDNA-X/L02細(xì)胞和含空質(zhì)粒的pcDNA3.0/L02細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞增殖活力檢測 采用CCK8法，取處于指數(shù)生長期的 pcDNA-X/L02細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基配成 8×103個/ml細(xì)胞懸液，接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后分別用0、8、16、32、64μmol/ L 5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-c)處理,設(shè)3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h、48 h和72 h，每孔加入CCK8溶液10 μL，孵育1 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm 波長處的光密度值(OD),計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(實驗組OD值-空白孔OD值)/(對照組OD值-空白孔OD值)×100%

1.4 5-Aza-c干預(yù)過表達HBx的人正常肝細(xì)胞 選取對數(shù)生長期的pcDNA-X/L02細(xì)胞和pcDNA3.0/L02細(xì)胞，以1×105個/ml的密度接種于六孔板，培養(yǎng)12 h貼壁，用16.0 μmol/L 5-Aza-c工作液，加入一組pcDNA-X/L02細(xì)胞，進行藥物干預(yù)，在另外一組pcDNA-X/L02細(xì)胞和pcDNA3.0/L02細(xì)胞，加入相同的不含藥物的完全培養(yǎng)基作為對照組，每24 h更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h后，分別收集三組細(xì)胞，進行下一步實驗。

1.5 肝組織和肝細(xì)胞HBx、DNMT3A、DNMT3B和SOCS-1mRNA水平檢測 采用RT-PCR法，收集22例肝癌和癌旁組織以及pcDNA3.0/L02、pcDNA-X/L02和pcDNA-X/L02+5-Aza-c三組細(xì)胞，檢測相關(guān)目的基因mRNA水平。使用總RNA提取試劑盒分別提取RNA，合成cDNA，配制 Mix 及其反應(yīng)體系，擴增cDNA。引物序列為：HBx：正向 5’-GCACTTCGCTTCACCTCTG-3’，反向 5’-GGTCGTTGACATTGCTGAGA-3’； DNMT3A：正向5’-TATTGATGAGCGCACAAGAGAGC-3’，反向 5’-GGGTGTTCCAGGGTAACATTGAG-3’；DNMT3B：正向 5’-CCAGCTGAAGCCCATGTT-3’， 反向 5’-ATTTGTCTTGAGGCGCTTG-3’； SOCS-1：正向 5’-AGGGAGCGGATGGGTGT-3’，反向 5’-GGTAGGAGGTGCGAGTTCAG-3’； β-actin：正向 5’-CCTGGCACCCAGCACAAT-3’，反向 5’-GGGCCGGACTCGTCATAC-3’。反應(yīng)條件為：預(yù)變性 95℃ 30 s；PCR反應(yīng) 95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)；溶解曲線：95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。采用相對定量法(2-ΔΔCT法)，以內(nèi)參β-actin進行校正，計算各個目的基因mRNA相對水平，各組實驗數(shù)據(jù)均獨立重復(fù) 3 次,取均值。

1.6 肝細(xì)胞HBx、DNMT3A、DNMT3B和SOCS-1蛋白表達檢測 采用Western-blot法，收集pcDNA 3.0/L02、pcDNA-X/L02和pcDNA-X/L02+5-Aza-c三組細(xì)胞，加裂解液，提取蛋白，測定蛋白濃度，充分變性蛋白質(zhì)，上樣進行 SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，使用含5%脫脂奶粉 TBST封閉液封閉。使用一抗稀釋液分別按照1∶2000、1∶250、1∶5000、1∶500、1∶500的比例稀釋抗體，在4 ℃ 下?lián)u動孵育12 h，繼續(xù)在室溫條件下，加羊抗鼠二抗或羊抗兔二抗(1∶4 000)孵育2 h 。在發(fā)光儀下進行化學(xué)發(fā)光顯影，應(yīng)用Image Lab軟件進行圖像獲取和分析。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織與癌旁組織HBx、DNMT3A、DNMT3B和SOCS-1 mRNA水平比較 肝癌組織HBx和DNMT3A mRNA水平顯著高于癌旁組織，而SOCS-1 mRNA水平顯著低于癌旁組織(表1，表1)。

表1 癌組織和癌旁組織基因mRNA水平比較

2.2 5-Aza-c 對過表達HBx的人正常肝細(xì)胞活性的影響 與對照組比，隨5-Aza-c濃度增高，過表達HBx的人正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞活性下降 (圖1)。

圖1 5-Aza-c對pcDNA-X/L02細(xì)胞活性的影響

2.3 三組細(xì)胞基因水平和蛋白表達比較 與對照pcDNA3.0/L02細(xì)胞比，pcDNA-X/L02細(xì)胞HBx mRNA水平及其蛋白表達顯著升高，而SOCS-1 mRNA水平及其蛋白表達顯著降低(P<0.05，表2、圖2)。

表2 三組細(xì)胞HBx、DNMT3A、DNMT3B和比較

圖2 三組細(xì)胞HBx、DNMT3A、DNMT3B和SOCS-1蛋白表達比較

3 討論

HBx被廣泛認(rèn)為是一種多功能病毒調(diào)控子，除了在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白質(zhì)降解方面發(fā)揮的作用外，它還在HCC的發(fā)生和調(diào)節(jié)DNA甲基化修飾方面起作用[8-11]。SOCS1作為一個潛在的抑癌基因，是細(xì)胞因子受體信號通路和Toll樣受體信號通路的重要負(fù)反饋因子，對機體的免疫調(diào)節(jié)有重要的作用，也與腫瘤發(fā)生有密切的聯(lián)系[12，13]。

本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)L02細(xì)胞經(jīng)HBx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞HBx mRNA 水平和SOCS-1基因啟動子甲基化水平升高，SOCS-1 mRNA水平及其蛋白表達降低，L02細(xì)胞增殖和遷移能力異常增強，從而導(dǎo)致肝癌的發(fā)生[14]。HBx增加ASPP2 基因啟動子區(qū)域，招募DNMT1和DNMT3A，從而啟動基因啟動子區(qū)域高甲基化，抑制ASPP2基因的表達[15，16]。HBx通過與DNMT3A之間的相互作用誘發(fā)不同基因位點發(fā)生表觀遺傳學(xué)修飾，特異性調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄活性[17]。

在本實驗，我們發(fā)現(xiàn)在乙型肝炎相關(guān)肝癌組織，HBx、DNMT3A mRNA水平顯著高于癌旁組織，而SOCS-1 mRNA水平顯著低于癌旁組織。在體外實驗也再次證明了在人L02細(xì)胞過表達HBx可以使SOCS-1基因表達下調(diào)。實驗結(jié)果表明，HBx可以通過上調(diào)DNMT3A表達使SOCS-1基因下調(diào)，為進一步探索HBV介導(dǎo)HCC發(fā)生的表觀遺傳學(xué)機制提供了更多的實驗依據(jù)。

值得注意的是，盡管有研究表明新生甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3B在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中有重要的促甲基化作用，而我們的研究表明在過表達HBx的pcDNA-X/L02細(xì)胞，DNMT3B mRNA水平及其蛋白質(zhì)表達相較于表達空質(zhì)粒的pcDNA3.0/L02細(xì)胞和藥物干預(yù)組，均無明顯有意義的變化。其中的原因可能與使用不同基因型的HBx質(zhì)粒和不同的肝細(xì)胞株有關(guān)，或者HBx介導(dǎo)SOCS-1基因表達降低的過程與DNMT3B表達水平無直接的關(guān)聯(lián)，而是取決于HBx與DNMT3B之間的蛋白質(zhì)相互作用。這個疑問可以通過進行免疫共沉淀實驗進一步證明。同時，本研究表明HBx介導(dǎo)DNMT3A表達上調(diào)與大多數(shù)研究一致，但其中具體的分子機制仍不十分清楚，有體外研究發(fā)現(xiàn)HBx可以通過下調(diào)miR-101靶向升高DNMT3A表達，誘導(dǎo)抑癌基因RASSF1、PRDM2、GSTP1和RUNX3基因啟動子區(qū)高甲基化，使基因表達降低，促進腫瘤的形成和進展[18]。

SOCS-1被認(rèn)為是腫瘤抑制基因。SOCS-1基因甲基化與腫瘤發(fā)生之間的聯(lián)系逐漸成為研究的熱點。有研究在SOCS-1基因高甲基化引起內(nèi)源性SOCS-1表達降低的腫瘤組織對上調(diào)SOCS-1的表達進行了探討。研究發(fā)現(xiàn)，在這些腫瘤細(xì)胞，恢復(fù)SOCS-1表達可以抑制乳腺癌細(xì)胞的集落生長和黑色素瘤細(xì)胞向大腦轉(zhuǎn)移。去甲基化作用的藥物，例如5-氮雜-2′-脫氧胞苷，通過抑制DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶活性，降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)抑癌基因甲基化水平，導(dǎo)致抑癌基因高表達，并以此作為抗腫瘤治療的潛在策略[19]。事實上，近年來有許多研究報道去甲基化藥物5-氮雜-2′-脫氧胞苷可用來治療多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合癥和急性髓細(xì)胞性白血病等血液系統(tǒng)惡性疾病，并且取得了良好的療效[20]。除此之外，5-氮雜-2′-脫氧胞苷也已被證明在胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞能使SOCS-1基因去甲基化并顯著地抑制體內(nèi)腫瘤生長[12]。我們的體外細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)，HBx可以通過上調(diào)DNMT3A表達使SOCS-1發(fā)生表觀遺傳學(xué)基因下調(diào)，使用去甲基化藥物5-Aza-c干預(yù)后DNMT3A表達下降，SOCS-1基因表達恢復(fù)，符合表觀遺傳學(xué)可逆性的特點，表明了這條通路可能成為治療肝癌的潛在干預(yù)靶點，提示去甲基化藥物結(jié)合傳統(tǒng)有限的治療方法可能會成為有前景的肝癌治療新策略[17]，但是仍需要更廣泛的研究進一步評估臨床療效。