趙文君，律鳳霞，艾 鑫

（牡丹江師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011）

灰樹花（Griflola frondosa）又名栗蘑、蓮花菌、貝頁(yè)多孔菌等，素有“食藥用菌王子”的美譽(yù)，分類學(xué)上隸屬于真菌界、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、多孔菌科，其子實(shí)體肉質(zhì)，珊瑚狀分枝層疊似菊，富含多種糖類、酚類和酸類等活性物質(zhì)，具有抗氧化、抑病毒、抑腫瘤活性等生理作用，是一種食藥兼用的珍稀食用菌.［1-4］近幾年食用菌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究?jī)?nèi)容大幅增加，但對(duì)灰樹花子實(shí)體形成機(jī)制及酸性代謝物質(zhì)在病原菌中的生物防治作用研究少見(jiàn)報(bào)導(dǎo).［5-6］本研究提取灰樹花菌原基總RNA，基于SBS（sequencing by synthesis）技術(shù)，用IIIumina Hiseq高通量平臺(tái)對(duì)RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)原始數(shù)據(jù)拼接、過(guò)濾、重建形成轉(zhuǎn)錄組Unigene數(shù)據(jù)，與5大數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能注釋比對(duì)、分類，研究其酸性物質(zhì)代謝路徑，為灰樹花在植物病害生物防治中的應(yīng)用提供理論依據(jù)，為今后深入開展灰樹花活性物質(zhì)研究和種質(zhì)資源的利用提供依據(jù).［7-10］

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

灰樹花菌株牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食用菌研發(fā)中心提供.

儀器壓力蒸汽滅菌器（DSX-280B），超凈工作臺(tái)，醫(yī)用離心機(jī)（H1650R），電泳儀（DYY-6D），PCR擴(kuò)增儀（PTC-100）.

1.2 方法

試驗(yàn)材料制備母種培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，胰蛋白胨10 g，KH2PO41.5 g，定容至1 L，pH值4.5～5.栽培種培養(yǎng)基：木屑80%，麥麩9%，石膏粉1%，腐殖土10%；含水量60～65%，pH值5.5～6.5.灰樹花子實(shí)體原基：灰樹花液體培養(yǎng)后菌絲球接種到栽培菌袋內(nèi)，24℃恒溫培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿菌袋，覆土保濕栽培，待子實(shí)體拱出土面后采集.

RNA的提取Plant Total RNA Islation Ki（50T）試劑盒提取灰樹花子實(shí)體總RNA，檢測(cè)RNA的完整性和污染情況，合格的RNA保存用于后續(xù)測(cè)序.

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)處理及分析過(guò)濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)，去除5’或3’末端質(zhì)量值低于20或者含N的堿基，去除trim后reads長(zhǎng)度低于75 bp的序列及接頭序列.［11］采用組裝軟件Trinity（v2.2.0）對(duì)樣品數(shù)據(jù)從頭進(jìn)行組裝，得到長(zhǎng)的非冗余的Unigene序列.［12，13］將Unigene序列與Nr，COG，SwissProt，KEGG，GO等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得Unigene的注釋信息.

2 結(jié)果分析

2.1 Unigene組裝

利用Trinity軟件對(duì)測(cè)序獲得的原始reads數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，數(shù)據(jù)總堿基數(shù)達(dá)102348 417 bp（97.61 M），最短長(zhǎng)度為25 bp，最長(zhǎng)長(zhǎng)度為21111 bp，平均長(zhǎng)度為47.8 bp，N50為47 bp，GC堿基含量為54.29%.處理后重新獲得38189個(gè)Unigene，總堿基數(shù)為48354 644 bp，平均長(zhǎng)度為1266.19 bp，最短Unigene為201 bp，最長(zhǎng)Unigene12658 bp，N50為2028 bp，GC堿基含量為52.76%.說(shuō)明從頭組裝的數(shù)據(jù)質(zhì)量較好.見(jiàn)圖1.

圖1 Unigene不同長(zhǎng)度餅狀分布圖

圖1顯示，Unigene長(zhǎng)度主要集中在200～500 bp之間，占比34.24%；500～1000 bp（20.01%）和大于2000 bp（20.38%）的Unigene數(shù)量相近.

通過(guò)BLAST程序?qū)⒒覙浠║nigene分別與Nr，Swissprot，KEGG，COG等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì).由表1可以看出，共有31928個(gè)Unigene被有效注釋，其中有1485個(gè)Unigene在四個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中共同注釋，占總數(shù)的3.89%；有14192個(gè)Unigene在至少兩個(gè)以上的數(shù)據(jù)庫(kù)中共同比對(duì)，占總數(shù)的37.16%.在Nr數(shù)據(jù)庫(kù)中被注釋到的Unigene最多有31454個(gè)，占總數(shù)的82.36%；在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中被注釋到的Unigene個(gè)數(shù)最少為1832個(gè)，占總數(shù)的4.8%.

表1 灰樹花Unigene的功能注釋不同數(shù)據(jù)庫(kù)分布情況

2.2 UniGene的Nr數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析

灰樹花Unigene序列與Nr數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，有31454個(gè)（82.36%）Unigene被有效注釋.在Nr數(shù)據(jù)庫(kù)中，匹配序列相似度達(dá)到80%以上的Unigene有18893個(gè)（60.07%），匹配序列相似度在40%～80%的有12134個(gè)（38.58%），匹配序列相似度低于40%的有427個(gè)（1.36%）.

灰樹花Unigene在Nr數(shù)據(jù)庫(kù)中同源匹配排序前10的物種有：灰樹花菌（Griflola frondosa）24896個(gè)（79.15%），繡球菌（Sparassis crispa）1075個(gè)，小鱗多孔菌（Polyporus brumalis）966個(gè)，Obba rivulosa 878個(gè)，污叉絲孔菌（Dichomitus squalens）571個(gè)，紅栓菌（Trametes cinnabarina）551個(gè)，絨毛栓菌（Trametes pubescens）805個(gè)，F(xiàn)ibroporia radiculosa 354個(gè)，離 心 射 脈 革 菌（Phlebia centrifuga）116個(gè)，赭 黃 齒 耳（Steccherinum ochraceum）104個(gè)，表明灰樹花序列及基因功能研究在Nr數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的數(shù)量較多.

2.3 Swissprot數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析

Swissprot數(shù)據(jù)庫(kù)中有被注釋Unigene12357個(gè)，匹配同源序列相似度達(dá)到高于80%的Unigene有998個(gè)（8.08%），同源相似度在40%～80%有620個(gè)（50.16%），同源相似度小于40%的有516個(gè)（41.76%）

2.4 UniGene的GO數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析

共有12234個(gè)灰樹花Unigene在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中被注釋到.主要涉及分子學(xué)功能、生物途徑和細(xì)胞組分3大主類60個(gè)亞分類.在分子功能中含有19個(gè)功能組，其中結(jié)合功能和催化活性功能的UniGene數(shù)量最多；細(xì)胞組分含有20個(gè)亞類組，參與細(xì)胞成分的Unigene數(shù)量最多；生物過(guò)程含有21個(gè)亞類組，參與細(xì)胞過(guò)程的Unigene數(shù)量最多.

2.5 UniGene的KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析

灰樹花Unigene在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中1832個(gè)被有效注釋，占總數(shù)的4.8%.KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的生物通路分四大主類：細(xì)胞過(guò)程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理和新陳代謝，內(nèi)含20條二級(jí)亞類.其中12條與新陳代謝相關(guān)，涉及Unigene數(shù)量：碳水化合物代謝399個(gè)，氨基酸代謝190個(gè)，核苷酸代謝135個(gè)，糖的生物合成和代謝65個(gè)，萜類和聚酮類化合物代謝11個(gè)，輔助因子和維生素代謝63個(gè)，其他氨基酸代謝82個(gè).其次，遺傳信息處理有4條通路1067個(gè)基因，細(xì)胞過(guò)程有2條通路70個(gè)基因，環(huán)境信息處理有2條通路273個(gè)基因.

2.6 UniGene的COG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析

灰樹花UniGene在COG數(shù)據(jù)庫(kù)中有12248個(gè)被注釋.一般功能預(yù)測(cè)被注釋的最多為1930個(gè)（占15.76%），其次是翻譯后的修飾1279個(gè)（占10.44%）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制1102個(gè)（占9%）、次生代謝產(chǎn)物的合成，運(yùn)輸和分解代謝1017個(gè)（占8.3%），細(xì)胞活力被注釋的最少只有11個(gè)（占9%）.

3 討論與結(jié)論

研究采用Illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)灰樹花菌原基進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并獲得了大量轉(zhuǎn)錄組信息.灰樹花栽培誘導(dǎo)形成子實(shí)體原基，提取總RNA處理后轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得38189個(gè)Unigene，平均長(zhǎng)度1266.19 bp.Unigene與Nr數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，與灰樹花菌相似序列最多.袁衛(wèi)東［14］和聶文強(qiáng)［15］等人在2012年和2017年采用高通量測(cè)序技術(shù)分別對(duì)灰樹花子實(shí)體和菌絲體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共獲得63137個(gè)Unigene和18077個(gè)Unigene，與Nr數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)兩人數(shù)據(jù)均與變色栓菌的相似序列最多.上述兩人數(shù)據(jù)結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)結(jié)果不一致，推測(cè)可能是變色栓菌與灰樹花菌同屬于多孔菌科，兩者的相似序列較多.近年來(lái)灰樹花的研究不斷深入，灰樹花菌在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列也更加完善，可以在數(shù)據(jù)庫(kù)中直接比對(duì)大部分灰樹花序列.

在Swissprot數(shù)據(jù)庫(kù)中檢測(cè)到蛋白序列同源12357條；與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，1832個(gè)Unigene分為20條生物通路，最多的是代謝通路，有12條，涉及2484個(gè)Unigene；與GO數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，12234個(gè)Unigene，分為生物過(guò)程、分子功能、細(xì)胞組成3大類60個(gè)分支；與COG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，12248個(gè)Unigene.此外，還有6261個(gè)Unigene在數(shù)據(jù)庫(kù)中未得到注釋，推測(cè)可能是灰樹花的特異性新基因、非編碼RNA序列或目前公共基因數(shù)據(jù)庫(kù)尚未完善.通過(guò)生物信息學(xué)分析，可為挖掘新功能基因、種質(zhì)資源創(chuàng)新、遺傳多樣性分析、確定活性成分合成路徑等提供新思路.