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        全自動固相萃取-高效液相色譜法測定 醬鹵肉制品中胭脂紅的優(yōu)化

        2022-11-21 09:25:06蘇駿敏沈昌瑩張樹權(quán)
        現(xiàn)代食品 2022年20期
        關(guān)鍵詞:胭脂紅萃取柱氨水

        ◎ 蘇駿敏,沈昌瑩,張樹權(quán)

        (東莞市食品藥品檢驗所,廣東 東莞 523808)

        胭脂紅,又稱為酸性紅18、麗春紅4R,屬于合成著色劑,是一種被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中的單偶氮類人工合成色素[1]。人工合成色素與天然色素相比,具有著色能力強、穩(wěn)定性好、成本低廉等優(yōu)勢[2]。因此醬鹵肉制品在生產(chǎn)過程中有時會加入胭脂紅,以改善食品的色澤外觀,提高人們的食欲。但人工合成色素具有慢性毒性,在人體內(nèi)蓄積分解后,有可能會轉(zhuǎn)化成致癌物質(zhì),且具有致畸性,長期過量使用危害人體健康[3-8]。同時,不法分子可能通過使用胭脂紅掩蓋變質(zhì)肉等不良原料的外觀[9-10]。依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》(GB 2760—2014)[11]的規(guī)定,醬鹵肉制品中禁止使用胭脂紅,但仍存在不少不法商販在醬鹵肉制品生產(chǎn)過程中超范圍使用胭脂紅。目前,測定食品中胭脂紅的國標(biāo)檢測方法有 GB/T 9695.6—2008[12]和GB 5009.35—2016[13],該檢測方法前處理操作步驟煩瑣,均采用聚酰胺吸附法,實驗過程中有大量目標(biāo)物損失,且對于油脂含量較高的樣品在檢測中易出現(xiàn)提取率低、凈化效果不佳、回收率較低等問題,不適用于大批量樣品的檢測。

        本研究在現(xiàn)行國標(biāo)檢測方法基礎(chǔ)上,對除脂、提取和凈化步驟進行改進,采用固相萃取法替代國標(biāo)方法中的聚酰胺粉末吸附法,通過全自動固相萃取儀,自動完成固相萃取凈化全過程,以期為醬鹵肉制品中胭脂紅的測定提供一種快捷、靈敏度高的檢測 方法。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與試劑

        Agilent 1260 Infinity II高效液相色譜儀(配備1240-元素光電二極管陣列檢測器,美國安捷倫科技有限公司);Fotector Plus高通量全自動固相萃取儀(廈門睿科儀器有限公司);3K 15高速冷凍離心機(德國Sigma公司);HS 501數(shù)顯型振蕩搖床(德國IKA公司);Evatros氮吹濃縮儀(Goojung公司);METTLER TOLEDO SevenExcellence型數(shù)字式精密酸度計(美國梅特勒公司)。

        甲醇(色譜純,德國Merck公司);無水乙醇、一水合檸檬酸(分析純,廣州化學(xué)試劑廠);氨水(分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠);乙酸銨(色譜純,山東西亞化學(xué)股份有限公司);甲酸(色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);Cleanert PWAX固相萃取柱(6 mL,500 mg)、Cleanert PA聚酰胺固相萃取柱(6 mL,1 g)(北京艾杰爾科技公司);Oasis WAX固相萃取柱(150 mg,6 mL)、Oasis HLB(200 mg,6 mL)(美國Waters公司);Bond Elut QuEChERS EMR-Lipid(美國安捷倫科技有限公司);0.45 μm水系濾膜(深圳逗點生物技術(shù)有限公司);實驗室用水為Milli-Q超純水;胭脂紅標(biāo)準(zhǔn)品(批號22001,濃度0.500 mg·mL-1,中國計量科學(xué)研究院)。

        樣品來自廣東省內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)抽樣。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 溶液配制

        甲醇-甲酸溶液(3+2,體積比):量取甲醇30 mL, 甲酸20 mL,混勻;15%氨水甲醇溶液:取15 mL氨水,用甲醇定容至100 mL;20%乙醇-氨溶液:量取20 mL氨水、70 mL無水乙醇、10 mL水,混勻;檸檬酸溶液:稱取20 g 檸檬酸,加水定容至100 mL;水(pH=6.0):取100 mL水,用檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH至6.0;水(pH=4.0):取100 mL水,用檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.0。

        1.2.2 樣品前處理

        稱取5 g(精確至0.001 g)粉碎均勻的醬鹵肉制品于50 mL離心管中,加入20%乙醇-氨溶液20 mL,旋緊蓋子,渦旋1 min,置于振蕩搖床上振蕩提取20 min 后,于-18 ℃冷凍30 min,8 000 r·min-1、4 ℃離心5 min, 上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,再分別用15 mL、10 mL提取液重復(fù)提取2次,合并提取液,用乙醇-氨溶液定容至刻度。精密移取上清液10 mL,70 ℃氮吹濃縮至約2 mL,混勻后待凈化。

        全自動固相萃?。阂来斡? mL甲醇、6 mL水(pH=6.0)活化后,上樣,再用6 mL水(pH=4.0)、6 mL甲醇-甲酸(3+2),6 mL水(pH=6.0)淋洗,6 mL 15%氨水甲醇溶液洗脫。收集洗脫液,70 ℃氮吹至近干,殘渣用1 mL水溶解,經(jīng)0.45 μm水系濾膜過濾后進高效液相色譜儀檢測分析。

        1.2.3 儀器條件

        (1)全自動固相萃取儀凈化程序詳見表1。

        表1 全自動固相萃取儀凈化程序表

        (2)液相色譜儀條件。色譜柱:Ultimate AQ-C18柱(4.6 mm ×250 mm,5 μm);流動相:A甲醇;B 0.02 mol·L-1乙酸銨溶液;梯度洗脫程序見表2;流速:1.0 mL·min-1;進樣量:20 μL;柱溫:30 ℃;檢測波長 508 nm。

        表2 流動相洗脫梯度表

        2 結(jié)果與分析

        2.1 提取條件的優(yōu)化

        2.1.1 除脂條件的優(yōu)化

        醬鹵肉制品中含有大量的油脂,其對胭脂紅的提取存在較大影響,且易在凈化時堵塞固相萃取柱,因此在前處理提取過程中需去除脂肪。根據(jù)文獻[14],QuEChERS EMR-Lipid可用于去除樣品基質(zhì)中脂質(zhì)的干擾,本文采用冷凍去脂(-18 ℃)、QuEChERS方法、石油醚除脂方法進行比較分析,考察3種除脂方法對醬鹵肉制品中胭脂紅提取的影響,提取率結(jié)果見 表3。

        表3 不同除脂方法下胭脂紅的提取率表(n=3)

        根據(jù)表3結(jié)果可知,經(jīng)過冷凍去脂的醬鹵肉制品的胭脂紅提取率最高,QuEChERS方法的提取率最低。同時,分別比較了-18 ℃、4 ℃、常溫下離心對樣品中胭脂紅提取率的影響,發(fā)現(xiàn)在4 ℃離心的提取率最高。因此,選用冷凍去脂并在4 ℃離心作為醬鹵肉制品的去脂方法。

        2.1.2 提取液氨水濃度的選擇

        胭脂紅極性較強,易溶于水,難溶于乙醇。用水作為提取液,提取效果不理想,難以提取出與蛋白質(zhì)結(jié)合的胭脂紅,且提取液中雜質(zhì)較多。因此,分別用10%、20%、30%、40%和50%氨水溶液作為提取液,考察氨水濃度對醬鹵肉制品中胭脂紅提取效率的影響,結(jié)果見圖1。

        由圖1可知,當(dāng)氨水濃度為20%時,胭脂紅的提取效率最高。當(dāng)氨水濃度在20%~50%時,隨著氨水濃度的升高,提取液愈發(fā)渾濁,這是由于氨水濃度過高導(dǎo)致樣品中的脂肪游離進提取液。氨水濃度過高不利于后續(xù)冷凍除脂,導(dǎo)致提取液中干擾增多,提取效率下降。因此最終選擇20%氨水溶液,即為無水乙醇-氨水-水(7∶2∶1)作為提取液。

        圖1 不同濃度氨水下胭脂紅的平均提取效率圖(n=3)

        2.1.3 固相萃取柱凈化條件的優(yōu)化

        本研究參考了國標(biāo)和相關(guān)文獻[12-17],研究考察胭脂紅標(biāo)準(zhǔn)溶液用Cleanert PWAX(500 mg,6 mL)、Cleanert PA(1 g,6 mL)、Oasis WAX(150 mg,6 mL)和Oasis HLB(200 mg,6 mL)固相萃取柱在不同淋洗和洗脫條件下的回收率,結(jié)果見表4。

        表4 不同固相萃取柱在不同淋洗、洗脫條件下的回收率表

        由表4可看出,Cleanert PWAX固相萃取柱回收率在0%~70%,Oasis HLB固相萃取柱回收率在19%~30%,且PWAX柱使用較低濃度的氨水甲醇溶液不能將胭脂紅從柱中洗脫出來,HLB柱對胭脂紅的吸附效果不佳,很難保留。Oasis WAX柱在使用水和甲醇淋洗時回收率較好,能達到70%以上,隨著氨水甲醇洗脫液濃度的增加,回收率逐漸上升。Cleanert PA萃取柱在使用甲醇-甲酸(3∶2)作為淋洗液,15%氨水甲醇洗脫時,效果較好,回收率可達到90%以上。

        對比胭脂紅樣品加標(biāo)提取液過柱凈化效果情況,結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明,經(jīng)Cleanert PA柱凈化后胭脂紅的回收率最高,Oasis HLB柱回收率最低。綜合考慮到胭脂紅的回收率,以及為降低廢液污染和節(jié)約成本,最終選擇水(pH=4.0)、甲醇-甲酸(3∶2)、甲醇作為淋洗液,15%氨水甲醇作為洗脫液,Cleanert PA作為凈化用固相萃取柱。

        圖2 不同固相萃取柱對胭脂紅回收率的影響圖(n=3)

        2.1.4 氮吹濃縮溫度的優(yōu)化

        將洗脫液收集于10 mL試管中,分別考察在55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃下進行氮吹的胭脂紅的回收率。結(jié)果表明,氮吹溫度對胭脂紅的回收率影響不明顯,考慮到在55 ℃~65 ℃下氮吹耗時較長,因此確定氮吹溫度為70 ℃。

        2.1.5 針式過濾器的選擇

        洗脫液經(jīng)氮吹至近干后,加水定容至1 mL,過 0.45 μm濾膜后上機檢測??疾鞂Ρ缺本┱裣杩萍加邢薰镜挠H水PTFE濾頭、津騰的PTFE濾頭和深圳逗點生物技術(shù)有限公司的PES濾頭、上海安譜實驗科技股份有限公司的Nylon濾頭。上機結(jié)果顯示,經(jīng)PES濾頭過濾的待測液中胭脂紅含量較高,原因可能是Nylon和PES膜對胭脂紅有所吸附[17-18]。故選用深圳逗點生物技術(shù)有限公司的PES濾頭用于洗脫液的過濾。

        2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍及方法檢出限

        準(zhǔn)確吸取適量胭脂紅標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量,用水稀釋成濃度為50.0 μg·mL-1的貯備液,再用水將貯備液依次稀釋成濃度為0.01 μg·mL-1、0.05 μg·mL-1、0.10 μg·mL-1、0.20 μg·mL-1、0.50 μg·mL-1、1.00 μg·mL-1、2.00 μg·mL-1、5.00 μg·mL-1、10.00 μg·mL-1和20.00 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,進樣量為10 μL,以胭脂紅質(zhì)量濃度(X,μg·mL-1)為橫坐標(biāo),峰面積(Y)為縱坐標(biāo),建立標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線。胭脂紅質(zhì)量濃度在0.01~50.00 μg·mL-1線性良好,相關(guān)系數(shù)≥0.999,斜率為0.827 3。按照本試驗前處理方法對加標(biāo)樣品進行處理,以色譜峰3倍信噪比 (S/N=3)求得方法檢出限(Limits of Detection,LOD),本方法胭脂紅的方法檢出限為0.02 mg·kg-1,低于國標(biāo)方法GB/T 9695.6—2008,滿足試驗要求。

        2.3 加標(biāo)回收率和精密度

        平行稱取18份醬鹵肉空白基質(zhì)樣品,分別在 0.1 mg·kg-1、5.0 mg·kg-1、10.0 mg·kg-13個水平下進行加標(biāo)回收試驗,每個濃度加標(biāo)樣品重復(fù)測定6次,加標(biāo)回收率結(jié)果見表5。由表5可知,胭脂紅在3個添加水平的回收率為85.2%~94.7%,滿足GB/T 27404—2008[19]附錄F.1中要求被測組分含量在0.1~1.0 mg·kg-1以及1~100 mg·kg-1,回收率分別在80%~110%、90%~110%的要求。與國標(biāo)方法GB/T 9695.6—2008回收率60%~80%相比較,本方法回收率顯著提升,且精密度良好,能滿足檢測的要求。

        表5 加標(biāo)回收率和精密度表(n=6)

        3 結(jié)論與討論

        本研究采用無水乙醇-氨水-水(7∶2∶1)作為提取液,通過冷凍除脂、低溫離心,使用聚酰胺固相萃取柱,采用固相萃取法替代國標(biāo)中的聚酰胺吸附法[20],并且全過程無需對提取液調(diào)節(jié)pH值,氮吹后定容即可上機,適用于富含油脂的醬鹵肉制品中的胭脂紅的測定。同時,采用全自動固相萃取儀進行凈化,無需人工干預(yù),自動完成固相萃取柱的活化、上樣、淋洗、洗脫和收集等全過程。采用本方法進行測定,回收率與相關(guān)文獻方法比較有較大的提升,方法檢出限低于國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T 9695.6—2008。同時,本方法前處理方便快捷,節(jié)省了提取凈化用試劑的消耗,降低污染,能滿足大批量醬鹵肉制品中胭脂紅的日常檢測。

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