華永晴 南欣榮，2 張海峰

(山西醫(yī)科大學 1第一醫(yī)院口腔科，山西 太原 030001；2口腔醫(yī)學院)

口腔鱗狀細胞癌(OSCC)是最常見的頭頸部惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在全球范圍內呈逐年上升趨勢〔1，2〕。吸煙、飲酒、無煙煙草及人乳頭瘤病毒感染均是誘發(fā)OSCC的危險因素。OSCC組織發(fā)生部位相對特殊，惡性程度高，浸潤性強，易發(fā)生區(qū)域淋巴結轉移或遠處轉移，且預后較差〔2〕。由于OSCC發(fā)病不明顯，當患者就診時50%以上患者已經處于晚期，盡管近年來腫瘤的診斷和治療方面已經取得很大的進步，外科手術及術后放、化療仍然是其常規(guī)治療手段，但OSCC預后仍未見明顯改善。微小RNA(miRNA)是一種長度為22 nt的小分子非編碼RNA，其廣泛存在于真核生物中，miRNA能對下游的靶基因mRNA的3′端非翻譯區(qū)(3′URT)進行特異性識別，還能和3′URT相結合進而促進mRNA的降解，最后完成對靶基因的翻譯過程進行抑制〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其還可以作為腫瘤的抑癌和致癌因子，進而參與腫瘤的生長、分化、增殖和凋亡等〔4〕。有報道證實，在OSCC的發(fā)生發(fā)展中有多種不同的miRNA參與，其對癌細胞能進行有效的抑制，且在多種癌癥中呈低表達〔5〕，但miRNA對OSCC的作用機制還沒有明確的報道。Ki67基因和周期密切相關，Ki67也是細胞增殖基因中的一種，其隨著細胞的增殖而高表達〔6〕。抑癌基因自殺相關因子(Fas)為非特異性抗原分子，廣泛存在于各種組織器官中，如腎上腺、腎臟、肝臟、心臟、肺等〔7〕。有臨床報道，在肺癌的發(fā)生發(fā)展中，F(xiàn)as的基因表達明顯下調〔8〕。研究發(fā)現(xiàn)，Ki67和Fas基因與口腔淋巴組織內淋巴結轉移有關〔9〕，但具體的表達尚不清楚。目前，關于miR-204-5p對Ki67及FasL的作用機制尚未見研究報告，因此本文旨在探究miR-204-5p對OSCC生物活性的作用及機制，并分析其對Fas和Ki67基因表達的影響。

1 材料和方法

1.1實驗細胞 本實驗所用的兩種細胞均從中國科學院上海細胞庫購買，分別為正?？谇簧掀ぜ毎礖IOEC，人OSCC細胞系CAL27。

1.2試劑和儀器 本實驗所有試劑和儀器分別為美國sigma公司生產的鏈霉素、DMEM培養(yǎng)基、青霉素、胎牛血清、二甲基亞砜(DMSO)；上海生工公司生產的Fas基因和Ki67基因；上海吉瑪制藥技術有限公司合成的miR-204-5p模擬物(mimic)和陰性(NC)對照模擬物；美國BD公司生產的Transwell試劑盒；東仁化學科技公司生產的CCK-8試劑盒；大連寶生物工程有限公司生產的實時熒光定量PCR分子試劑。

1.3實驗方法

1.3.1細胞培養(yǎng) 復蘇人正?？谇簧掀ぜ毎礖IOEC和人OSCC細胞系CAL27，轉入加有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，加入100 μg/ml的鏈霉素和100 μg/ml的青霉素以防止細菌污染，于CO2培養(yǎng)箱中進行傳代培養(yǎng)，要求培養(yǎng)箱中CO2含量為5%，溫度為37℃，所有操作在無菌條件下進行。每1～2 d換液一次，細胞單層貼壁生長，待長滿瓶底時，用0.25%胰蛋白酶消化液消化成單個細胞，選取進入對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.3.2細胞轉染 將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的OSCC細胞系CAL27，采用0.25%胰蛋白酶消化后接種于6孔細胞板中，待細胞融合度至80%～90%時，更換為無血清DMEM培養(yǎng)基，采用LipofectamineTM2000法進行轉染，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。實驗分為3組，空白組：CAL27細胞不轉染序列，正常培養(yǎng)；陰性對照組(NC組)：CAL27細胞轉染陰性對照序列進行培養(yǎng)；miR-204-5p組：把miR-204-5p mimic轉染至人OSCC細胞系CAL27中進行培養(yǎng)。

1.4qRT-PCR檢測miR-204-5p mRNA表達 分別取出HIOEC細胞和CAL27細胞，在兩組細胞中加入裂解液后對細胞總RNA進行提取，逆轉后所得的cDNA進行熒光反應實驗。所有反應嚴格按照反應的條件進行擴增，在95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，共循環(huán)40個，4℃環(huán)境中保存。取平均值后得到Ct值，計算方法用2-△△Ct法進行分析，引物序列：miR-204-5p正義鏈5′-GCACAATCAAGTCTAAACTGGAG-3′,反義鏈5′-TCATGGTCAGGAGGGTTGTA-3′；GAPDH正義鏈5′-GGCTGAGAACGGGAAGCTTGTCAT-3′，反義鏈5′-CAGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGA-3′。

1.5CCK-8檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期的CAL27細胞，胰酶消化成懸浮細胞，以每孔4×103個細胞傳到96孔板中，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h和96 h后對相應細胞進行轉染后，根據(jù)試劑說明書每孔加入10 μl CCK8試劑。培養(yǎng)箱中孵育2 h后，在酶標儀490 nm波長下檢測各孔吸光度A值，計算細胞生長速度(增殖倍數(shù)=細胞吸光度/0 h細胞吸光度)。

1.6Transwell小室檢測細胞侵襲 將CAL27細胞在無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，消化細胞，去除培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，調整細胞密度至3×105。接種到基質膠預處理的Transwell小室中。小室上層加人不含血清的培養(yǎng)基，下室加入含血清的培養(yǎng)基。在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，去除上室中的培養(yǎng)基，用棉簽擦去上層細胞，下層細胞結晶紫染色。每組隨機選取5個視野對染色細胞進行細胞計數(shù)并照相。

1.7流式細胞術檢測細胞凋亡情況 取干預后的3組CAL27細胞，所有細胞離心后進行收集處理，分別把100 μl結合緩沖液重懸細胞，5 μl膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)和5 μl的碘化丙啶(PI)溶液加入其中，把所有的溶液全部混勻后進行孵育，15 min后把400 μl結合緩沖液重懸細胞加入其中，最后用流式細胞儀對肺癌細胞的凋亡情況進行檢測。

1.8Western印跡檢測Fas和Ki67蛋白表達 取3組CAL27細胞，提取細胞中的蛋白，BCA試劑盒檢測提取的蛋白濃度，取60 μg上樣蛋白至十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 分離，轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗液中4℃搖床過夜，洗膜緩沖液洗3次，5 min/次；加二抗，室溫搖床上孵育2 h，洗膜緩沖液洗3次，5 min/次。加顯影液，顯影并拍照，使用Image Lab軟件分析目的蛋白的灰度值，得出相對表達量。

1.9統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1HIOEC和CAL27細胞中miR-204-5p mRNA表達比較 和人正常口腔上皮細胞系HIOEC相比，人OSCC細胞系CAL27中miR-204-5p mRNA表達顯著降低(1.00±0.11 vs 0.52±0.21;t=6.403,P<0.001)。

2.23組CAL27細胞中miR-204-5p mRNA表達比較 空白組和NC組中miR-204-5p mRNA表達無顯著差異(P>0.05)；miR-204-5p 組和NC組、空白組相比miR-204-5p mRNA表達明顯增多(P<0.05)，說明轉染成功，見表1。

表1 各組細胞中miR-204-5p mRNA表達及細胞侵襲數(shù)比較

2.33組CAL27細胞侵襲能力比較 空白組和NC組細胞的侵襲數(shù)量無明顯差異(P>0.05)；miR-204-5p組與NC組、空白組相比，細胞侵襲數(shù)量得到顯著抑制(P<0.05)，見表1、圖1。

2.43組CAL27細胞增殖能力比較 24 h各組細胞增殖情況無明顯差異(P>0.05)，48、72、96 h空白組和NC組細胞的增殖能力沒有顯著的差異性(P>0.05)；與空白組、NC組相比，miR-204-5p組口腔鱗狀細胞癌CAL27的增殖能力顯著降低(均P<0.05)，見表2。

表2 各組不同時間細胞增殖能力比較

2.53組CAL27細胞凋亡能力比較 空白組和NC組人口腔鱗狀細胞癌細胞系CAL27凋亡率無顯著差異(P>0.05)；與空白組、NC組相比較，miR-204-5p組細胞凋亡能力顯著增加(P<0.05)，見表3、圖2。

2.6Fas和Ki67蛋白表達比較 空白組和NC組CAL27細胞中Fas和Ki67蛋白表達無顯著差異(P>0.05)；與NC組及空白組相比較，miR-204-5p組中Fas蛋白表達顯著升高，Ki67蛋白表達得到明顯抑制(P<0.05)，見表3、圖3。

表3 各組細胞凋亡率、Fas蛋白和Ki67蛋白表達比較

3 討 論

OSCC是一種極其復雜的疾病，其是機體通過自身及外界因素的誘導，對局部組織細胞致癌因子的發(fā)揮進行促進，讓其失去正常的調控能力，進而導致細胞發(fā)生異常增生，形成沒有用的物質；OSCC與基因突變、表觀遺傳學改變、染色體異位、缺失及擴增有關。既往關于癌癥的焦點一直集中于蛋白編碼基因，而近年來研究發(fā)現(xiàn)基因轉錄組中只有34%的是蛋白編碼基因，而高達66%的是非編碼基因，包括長鏈非編碼RNA，反義RNA及miRNA，這些非編碼RNA同樣在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。學者研究發(fā)現(xiàn)，miRNA的異常改變與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，在此過程中miRNA充當癌基因或抑癌基因〔11〕。其中miR-204-5p被認為是一個抑癌基因，在多種腫瘤中發(fā)揮關鍵作用。miR-204-5p主要通過作用于下游的靶基因抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移，增加藥物的敏感性，且miR-204-5p在多種實體腫瘤中低表達，并與患者的臨床分期、淋巴結轉移及不良預后相關〔12〕。本研究結果顯示，和人正?？谇簧掀ぜ毎礖IOEC相比，OSCC中miR-204-5p mRNA明顯減少，可見其在OSCC中呈低表達。OSCC細胞增殖能力是決定其生長速度的重要因素之一，細胞侵襲能力是反映腫瘤細胞轉移潛能的重要指標〔13〕。本研究結果顯示，miR-204-5p干預后的OSCC的增殖和侵襲能力均受到了明顯的抑制，并且促進了OSCC細胞的凋亡，可見miR-204-5p能有效抑制OSCC的增殖和侵襲能力，同時促腫瘤細胞凋亡。Yin等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-204-5p可有效抑制大腸癌細胞的增殖和侵襲能力，其作用機制可能是通過下調RAB22A表達來發(fā)揮作用，進而增加miR-204-5p化療的敏感性。Wang等〔15〕實驗結果顯示，miR-204-5p可抑制胃癌細胞的增殖和遷移能力，其作用機制是通過調控表皮生長因子受體(EGFR)來實現(xiàn)。

Fas基因的編碼產物是FasL的受體，能夠在細胞內招募Fas死亡結構域相關蛋白(FADD)并介導死亡受體途徑的細胞凋亡〔16〕。有臨床研究報道，在胃癌的發(fā)生發(fā)展中，F(xiàn)as基因表達明顯下調；也有基礎實驗研究表明，抑制Fas表達能夠阻礙胃癌細胞的凋亡〔17〕。本文結果顯示Fas在口腔鱗狀細胞癌中呈低表達，轉染后的miR-204-5p組中Fas表達顯著升高。張薇〔18〕研究發(fā)現(xiàn)，OSCC FasL表達陽性組癌細胞細胞凋亡指數(shù)明顯低于FasL表達陰性組，OSCC Fas、FasL的表達與其形成有密切關系。Ki67是在于細胞增殖周期內的一種非蛋白性核蛋白，是一種增殖標記物〔19〕。Ki67蛋白在大多數(shù)良惡性腫瘤中高表達，被認為確定惡性腫瘤侵襲的一個有用的分子生物工具。Ki67蛋白表達在頭頸部腫瘤中已被描述為一個可靠的預后因素。Ki67是人類所有增生細胞中普遍存在的腫瘤標志性抗原，提示細胞有絲分裂的過度增殖是腫瘤惡變程度的關鍵環(huán)節(jié)，Ki67蛋白過表達可反映細胞增殖速度及活性程度，對良惡性腫瘤的鑒別具有重要的臨床意義。本研究結果顯示，在OSCC中Ki67蛋白表達明顯升高，miR-204-5p干預后發(fā)現(xiàn)Ki67表達得到了顯著的抑制，可見miR-204-5p能有效抑制OSCC中Ki67表達。劉冰華〔20〕研究發(fā)現(xiàn)，不論是血管內皮生長因子(VEGF)-C還是Ki67，其癌組織中淋巴管密度、陽性表達率及淋巴結轉移癌灶中淋巴管密度及陽性表達率均顯著高于相應的正常組織，證實了VEGF-C和Ki67的表達可能與口腔淋巴癌組織內淋巴管生成和淋巴結轉移有關。

本實驗證實miR-204-5p可有效抑制口腔鱗狀細胞癌的增殖和侵襲，促進其凋亡，其作用機制可能與促進Fas表達、抑制Ki67的活性有關，進而發(fā)揮改善OSCC生物學活性的作用。本實驗存在一定的不足，未加入藥物對照組，對于miR-204-5p、Ki67、Fas三者的關系未給出明確的實驗說明，在今天的實驗中，會加入更多研究方法，為OSCC的靶向治療提供參考。