周蕾 房輝 張守軍 張雅中 李冰

(唐山市工人醫(yī)院 1內(nèi)分泌二科，河北 唐山 063000；2急診科)

糖尿病是以葡萄糖代謝紊亂、血糖水平升高為 特征的內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病。長(zhǎng)期高血糖可引起腎、眼、心臟的慢性病變。肺毛細(xì)血管豐富，血容量較大，是糖尿病的重要靶器官，研究表明糖尿病可引起肺部纖維化〔1,2〕。在慢性高血糖狀態(tài)下，細(xì)胞外基質(zhì)的沉積導(dǎo)致肺纖維化，繼而發(fā)生阻塞性及限制性通氣功能障礙〔3〕。本研究通過(guò)建立糖尿病大鼠模型，觀(guān)察轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1/p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)傳導(dǎo)通路在糖尿病大鼠肺組織表達(dá)及達(dá)格列凈的干預(yù)作用，探討達(dá)格列凈通過(guò)調(diào)控TGF-β1/p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路影響糖尿病肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取8周齡左右清潔級(jí)健康SPF級(jí)SD雄性大鼠40只，體重220～260 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。所有大鼠置于通風(fēng)良好，相對(duì)濕度45%～55%，溫度為18～22℃的清潔動(dòng)物房?jī)?nèi)，自由飲食取水，并及時(shí)更換飼料。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 達(dá)格列凈(阿斯利康制藥有限公司)，鏈脲佐菌素(STZ，美國(guó) Sigma公司)，兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體、兔抗大鼠p38MAPK多克隆抗體、兔抗大鼠纖維連接蛋白(FN)多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)，山羊抗鼠 IgG 二抗(R&D 公司)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、免疫細(xì)胞化學(xué)法(SABC)試劑盒(美國(guó) Pierce 公司)，β-actin(批號(hào):CP10399，美國(guó) Abnova 公司)，二喹啉甲酸(BCA) 試劑盒(上海生工生物工程有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本 TaKaRa 公司)，血糖儀及血糖檢測(cè)試紙條(德國(guó)羅氏公司)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組與處理 將40只SD大鼠隨機(jī)分為A、B、C、D組，每組各10只，A組為對(duì)照組，B組為糖尿病組，C組為達(dá)格列凈治療4 w組，D組為達(dá)格列凈治療8 w組。除A組給予普通顆粒飼料外，其余3 組均給予高糖高脂飼料，喂養(yǎng)4 w后，禁食 12 h 后腹腔注射 STZ 60 mg/kg，72 h后尾靜脈采血測(cè)定空腹血糖(FPG)≥16.7 mmol/L 為模型復(fù)制成功。A組腹腔注射等量上述枸櫞酸緩沖液。C組、D組分別給予達(dá)格列凈達(dá)1 mg/kg，每天1次喂養(yǎng)，治療時(shí)間分別為4、8 w，A、B組予等體積生理鹽水喂養(yǎng)8 w。

1.2.2標(biāo)本收集與處理 末次給藥禁食12 h后，取大鼠尾末梢毛細(xì)血管全血測(cè)定FPG。殺檢前1 d空腹尾靜脈取血測(cè)定FPG、糖化血紅蛋白(HbA1c)及體重(BW)。大鼠HbA1c測(cè)定試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。大鼠于麻醉狀態(tài)下腹主動(dòng)脈取血，ELISA試劑盒于30 min內(nèi)進(jìn)行動(dòng)脈血?dú)夥治觯貉醴謮?PaO2)、氧飽和度(SaO2)、二氧化碳分壓(PaCO2)。用電子天平稱(chēng)量并記重量。留取各組大鼠肺組織標(biāo)記后放置-80℃保存。

1.2.3免疫組織化學(xué)(SP)染色 按照SP試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組TGF-β1、p38MAPK、FN蛋白表達(dá)情況。用病理圖像分析系統(tǒng) Image-Pro Plus6.0 進(jìn)行免疫組化圖像分析,陽(yáng)性表達(dá)是呈棕黃色顆粒。

1.2.4Western印跡 取出保存的肺臟組織，加入蛋白裂解液裂解肺組織，提取總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，取出20 μg 統(tǒng)一上樣進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后，凝膠移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜行轉(zhuǎn)膜反應(yīng)后加入封閉液，清洗之后添加一抗，4℃過(guò)夜孵育，添加二抗，隨后電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，置于凝膠成像儀中觀(guān)察TGF-β1、p38MAPK 、FN蛋白表達(dá)情況。

1.2.5RT-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)NF-κB mRNA的表達(dá) 取新鮮冰凍組織約100 mg，按照Trizol一步法提取RNA,取等量RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，取擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行電泳。以β-actin光密度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校正計(jì)算PCR產(chǎn)物相對(duì)含量。PCR 引物 用 Primer3在線(xiàn)引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)，PCR引物由上海生物工程有限公司合成，β-catenin正義鏈：5′-TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA-3′,反義鏈：5′-CACCAGAC-AGCACTGTGTTG-3′;核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB：正義鏈：5′-TGTGGTGGAGGACTTGCTGAGG-3′,反義鏈：5′-AGTGCTGCCTTGCTGTTCTTGAG-3′。退火溫度分別為58℃、61℃。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組FPG、HbA1c、BW、PaO2、SaO2、PaCO2水平比較 與A組比較，B組FPG、HbA1c、PaCO2水平均顯著升高，BW、PaO2、SaO2水平均顯著降低(均P<0.05)；與B組比較，C組和D組FPG、HbA1c、PaCO2水平均顯著降低，BW、PaO2、SaO2水平均顯著升高(均P<0.05)。C組和D組上述指標(biāo)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2肺組織病理學(xué)變化 與A組比較，B組肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，膠原纖維組織增生、變厚，肺泡間質(zhì)及毛細(xì)血管基底膜變厚，部分肺泡腔塌陷及萎縮。與B組比較，C組和D組肺組織結(jié)構(gòu)紊亂程度較前好轉(zhuǎn)，肺泡間質(zhì)及毛細(xì)血管基底膜較前變薄，肺泡腔萎縮甚至塌陷程度較前有所恢復(fù)。且D組較C組更明顯。見(jiàn)圖1。

2.3各組TGF-β1 p38MAPK、FN水平比較 免疫組化示B組肺組織中，TGF-β1、p38MAPK、FN呈間斷不連續(xù)分布表達(dá)于肺間質(zhì)及血管上皮細(xì)胞核周?chē)陌|(zhì)，著色較A組明顯加深，呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(P<0.01)。與B組比較，C組及D組著色相對(duì)較淺，且D組更為明顯。見(jiàn)圖2。免疫組化及Western印跡結(jié)果顯示：與A組比較，B組TGF-β1、p38MAPK、FN水平均顯著升高(均P<0.05)；與B組比較，C組和D組TGF-β1、p38MAPK、FN水平均顯著降低，且D組更顯著(均P<0.05)。見(jiàn)表2、表3、圖3。

表2 免疫組化檢測(cè)各組TGF-β1、p38MAPK 、FN的表達(dá)

表3 Western印跡檢測(cè)各組TGF-β1、p38MAPK、FN的表達(dá)

2.4各組肺組織中NF-κB mRNA比較 與A組(0.68±0.04)比較，B組NF-κB mRNA水平(2.12±0.02,P<0.05)顯著升高；與B組比較，C組和D組NF-κB mRNA水平(1.69±0.22，0.91±0.18)均顯著降低，且D組更顯著(均P<0.05)。見(jiàn)圖4。

3 討 論

糖尿病并發(fā)癥嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，而長(zhǎng)期的高血糖又可導(dǎo)致機(jī)體微炎性反應(yīng)加劇，損害肺功能〔4,5〕。Kopf等〔6〕研究指出，糖尿病前期及糖尿病患者中限制性通氣功能障礙者所占比例較高，主要表現(xiàn)為肺通氣功能障礙、小氣道功能障礙及彌散功能障礙，且肺彌散功能下降與全身微血管病變相一致〔7〕。研究表明TGF-β1/p38MAPK參與組織纖維化的發(fā)生與發(fā)展〔8,9〕。TGF-β1被認(rèn)為是促纖維化形成的重要細(xì)胞因子〔10〕。TGF-β1可由所有類(lèi)型的細(xì)胞及浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞分泌，反過(guò)來(lái)也參與纖維化的各個(gè)環(huán)節(jié)，包括刺激細(xì)胞外基質(zhì)合成、抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解；刺激上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌纖維細(xì)胞，促細(xì)胞與基質(zhì)黏附增強(qiáng)，促細(xì)胞外基質(zhì)沉積〔11〕。FN是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分，其含量增多是肺纖維化進(jìn)展的重要指標(biāo)。TGF-β1可特異性磷酸化和激活 p38MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，p38MAPK在肺纖維化成纖維細(xì)胞中過(guò)度激活，使細(xì)胞膠原合成增加，最終導(dǎo)致肺纖維化〔12,13〕。NF-κB是p38MAPK下游信號(hào)分子，包括p65、 c-ReI、ReIB、p50和p52 5種亞型，各亞型之間相互組合形成二聚體〔14〕。NF-κB作為p38MAPK 下游信號(hào)分子，p38MAPK 活化后能激活 NF-κB 信號(hào)通路，促使 NF-κB 進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控下游靶基因發(fā)揮作用〔15〕。

本研究通過(guò)基因和蛋白水平驗(yàn)證，糖尿病大鼠肺組織TGF-β1、FN水平明顯增加，肺組織發(fā)生纖維化。其機(jī)制可能與TGF-β1/p38MAPK信號(hào)通路的活化相關(guān)。糖尿病大鼠肺組織p38MAPK、NF-κB表達(dá)升高，提示TGF-β1/p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路活化增加，上調(diào)了NF-κB，增加了糖尿病大鼠肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展。而經(jīng)過(guò)達(dá)格列凈治療后，特別是在血糖不在繼續(xù)下降的情況下，TGF-β1、FN表達(dá)量仍較前下降，考慮抑制了TGF-β1/p38MAPK信號(hào)通路，下調(diào)了NF-κB的表達(dá)。綜上，TGF-β1/p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路可能是導(dǎo)致糖尿病大鼠肺損傷的重要途徑之一。達(dá)格列凈其效應(yīng)機(jī)制可能是抑制了TGF-β1/p38MAPK 信號(hào)通路的活化，發(fā)揮了抗纖維化的作用。

糖尿病患者血糖及并發(fā)癥的控制有效改善糖尿病患者生活質(zhì)量。筆者推測(cè)，達(dá)格列凈改善糖尿病肺纖維化的作用可能是多靶點(diǎn)的，通過(guò)調(diào)控 TGF-β1/p38MAPK 通路活性來(lái)減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，抑制肺組織發(fā)生纖維化來(lái)發(fā)揮肺組織保護(hù)作用。綜上，達(dá)格列凈預(yù)防和治療糖尿病肺纖維化可能將是今后臨床研究的一個(gè)重要方向。在糖尿病并發(fā)癥的治療和預(yù)防方面，TGF-β1/p38MAPK信號(hào)通路可能也可作為特異性的干預(yù)靶點(diǎn)。