陳聯(lián) 陳學(xué)誠(chéng)

(1福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，福建 福州 350005；2福州中德骨科醫(yī)院綜合內(nèi)科)

老年人是肺癌的高發(fā)群體，發(fā)病隱匿且惡性程度高，目前仍存在手術(shù)復(fù)發(fā)率高、5年生存率低等問(wèn)題，探尋新的治療靶點(diǎn)對(duì)改善患者預(yù)后具有積極作用〔1〕。去乙?；饔脜⑴c了真核基因組的表達(dá)調(diào)控，組蛋白乙?；腿ヒ阴；揎椩谄渲邪l(fā)揮重要作用〔2〕。沉默信息調(diào)節(jié)因子相關(guān)酶類是一系列依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、核心區(qū)高保守的組蛋白去乙?；浮?〕。人體沉默信息調(diào)節(jié)因子家族有7個(gè)亞型，其中沉默信息調(diào)節(jié)因子5位于線粒體基質(zhì)〔4〕。研究者發(fā)現(xiàn)，沉默信息調(diào)節(jié)因子5缺乏會(huì)抑制三磷酸腺苷(ATP)生成，同時(shí)能夠激活小鼠心臟組織中的腺苷一磷酸(AMP)活化的蛋白激酶〔5〕。沉默信息調(diào)節(jié)因子5失活能夠抑制絲氨酸分解代謝，抑制肺癌腫瘤生長(zhǎng)〔6〕。但目前關(guān)于沉默信息調(diào)節(jié)因子5在肺癌中作用及相關(guān)機(jī)制的研究仍十分少見。本研究探討沉默信息調(diào)節(jié)因子5對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)特征的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人肺癌細(xì)胞NCI-H838、人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B均購(gòu)于上海奧陸生物科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于沃卡威(北京)生物有限公司；空載體病毒、重組人沉默信息調(diào)節(jié)因子5購(gòu)于美國(guó)BioVision公司；Stat3激動(dòng)劑大腦通透性的神經(jīng)保護(hù)肽(Colivelin)購(gòu)于美國(guó)TargetMol公司；CCK-8試劑盒、Transwell小室、Matrigel基底膠均購(gòu)于北京沃比森科技有限公司；總RNA提取試劑盒(Trizol法)購(gòu)于上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；兔抗人沉默信息調(diào)節(jié)因子5、Stat3、p-Stat3單克隆抗體，鼠抗人Nanog單克隆抗體購(gòu)于奧維亞生物技術(shù)有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組 使用含10%胎牛血清、鏈霉素100 μg/ml、青霉素50 IU/ml的RPMI1640培養(yǎng)基，37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育，每24～48 h換液，觀察細(xì)胞匯合超過(guò)80%時(shí)消化傳代。實(shí)驗(yàn)分組如下：空白對(duì)照組(常規(guī)培養(yǎng)基)；空載體轉(zhuǎn)染組(常規(guī)培養(yǎng)基+空載體病毒)；沉默信息調(diào)節(jié)因子5過(guò)表達(dá)組(常規(guī)培養(yǎng)基+重組人沉默信息調(diào)節(jié)因子5病毒)；Colivelin組(常規(guī)培養(yǎng)基+重組人沉默信息調(diào)節(jié)因子5病毒+0.5 μmol/L Colivelin)；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)沉默信息調(diào)節(jié)因子5 mRNA表達(dá) 總RNA提取試劑盒收集人肺癌細(xì)胞NCI-H838、人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B及空白對(duì)照組、空載體轉(zhuǎn)染組、沉默信息調(diào)節(jié)因子5過(guò)表達(dá)組肺癌細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。PCR擴(kuò)增引物由上海為青生物工程有限公司合成。沉默信息調(diào)節(jié)因子5上游引物：5′-CTCATGTAGTGGTCGTCGTAG-3′，下游：5′-CCGTCATTAGGCGGT-CGGAAC-3′。β-actin上游引物：5′-CTTGTAACGG-GTCGTGATGCC-3′，下游：5′-AAAGTCCCCTCTTTAAACCGA-3′。PCR體系15 μl，包括dNTP Master Mix 5 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl、模板DNA 4 μl、雙蒸餾水4 μl。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，50℃復(fù)性40 s，共40個(gè)循環(huán)，72℃延伸2 min。以參照基因β-actin為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相對(duì)定量。

1.4CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 將4組細(xì)胞按1×105/ml密度鋪于96孔板中，每孔細(xì)胞培養(yǎng)基100 μl，放入37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，取出后每孔加入濃度10%的CCK-8試劑100 μl，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，上酶標(biāo)儀讀取450 nm處的吸光度值反映細(xì)胞增殖能力。

1.5劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將肺癌細(xì)胞按1×105/ml密度鋪于6孔板中，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)到90%時(shí)，使用移液槍頭進(jìn)行垂直劃痕，根據(jù)分組向培養(yǎng)孔中加入對(duì)應(yīng)的干預(yù)藥物，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。放入37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，光學(xué)顯微鏡下觀察劃痕寬度變化并拍照，測(cè)量細(xì)胞劃痕面積，計(jì)算劃痕愈合率(%)=(孵育前劃痕面積-孵育24 h后劃痕面積)/孵育前劃痕面積×100%。

1.6Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 Matrigel基底膠與RPMI1640培養(yǎng)基按1∶9的比例稀釋，向Transwell上室中加入50 μl，放入37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，將肺癌細(xì)胞按1×105/ml密度加入上室100 μl；向Transwell下室加入對(duì)應(yīng)的干預(yù)藥物，放入37℃ CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h，結(jié)晶紫染色，光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)量。

1.7Western印跡檢測(cè)沉默信息調(diào)節(jié)因子5及Stat3/Nanog信號(hào)通路蛋白表達(dá) RIPA細(xì)胞裂解液提取人肺癌細(xì)胞NCI-H838、人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B及4組肺癌細(xì)胞的總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測(cè)定蛋白濃度，行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉(zhuǎn)法將電泳得到的目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，使用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫下封閉1 h，滴加一抗：兔抗人沉默信息調(diào)節(jié)因子5、Stat3、p-Stat3單克隆抗體，鼠抗人Nanog單克隆抗體；4℃孵培育過(guò)夜。之后滴加二抗：山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG，室溫下孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影，使用Image J軟件讀取各條帶的灰度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1沉默信息調(diào)節(jié)因子5在人正常肺上皮細(xì)胞和肺癌細(xì)胞中的表達(dá) 肺癌細(xì)胞NCI-H838中沉默信息調(diào)節(jié)因子5 mRNA(0.35±0.11)、蛋白表達(dá)水平(0.31±0.09)明顯低于人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B(0.92±0.05、0.88±0.07；t=21.965、19.208，均P=0.000)。

2.2過(guò)表達(dá)沉默信息調(diào)節(jié)因子5驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 沉默信息調(diào)節(jié)因子5過(guò)表達(dá)組肺癌細(xì)胞NCI-H838中沉默信息調(diào)節(jié)因子5 mRNA、蛋白表達(dá)水平高于空載體轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示沉默信息調(diào)節(jié)因子5轉(zhuǎn)染成功。見圖1、表1。

2.3各組肺癌細(xì)胞增殖能力比較 沉默信息調(diào)節(jié)因子5過(guò)表達(dá)組細(xì)胞增殖(0.39±0.12)明顯低于空白對(duì)照組(0.75±0.07)和空載體轉(zhuǎn)染組(0.78±0.09；t=14.859、15.307，P=0.001、0.000)；Colivelin組細(xì)胞增殖(0.56±0.10)明顯高于沉默信息調(diào)節(jié)因子5過(guò)表達(dá)組(t=8.551，P=0.018)；細(xì)胞增殖能力在空載體轉(zhuǎn)染組與空白對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.169，P=0.905)。

2.4各組肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力比較 沉默信息調(diào)節(jié)因子5過(guò)表達(dá)組細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯低于空載體轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組(P<0.01)；Colivelin組細(xì)胞遷移、侵襲能力明顯高于沉默信息調(diào)節(jié)因子5過(guò)表達(dá)組(P<0.05)；細(xì)胞遷移、侵襲能力在空載體轉(zhuǎn)染組與空白對(duì)照組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.5各組肺癌細(xì)胞Stat3/Nanog信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)分析 沉默信息調(diào)節(jié)因子5過(guò)表達(dá)組肺癌細(xì)胞中p-Stat3、Nanog蛋白表達(dá)水平明顯低于空白對(duì)照組和空載體轉(zhuǎn)染組(P<0.05)；Colivelin組肺癌細(xì)胞中p-Stat3、Nanog蛋白表達(dá)水平明顯高于沉默信息調(diào)節(jié)因子5過(guò)表達(dá)組(P<0.05)。Stat3蛋白表達(dá)水平在各組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖2。

3 討 論

沉默調(diào)節(jié)蛋白是一類具有多種代謝調(diào)節(jié)酶活性的蛋白家族，最初研究認(rèn)為是遺傳沉默因子，后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)沉默調(diào)節(jié)蛋白在延長(zhǎng)酵母壽命方面作用明顯。但目前關(guān)于沉默調(diào)節(jié)蛋白在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用仍未完全明確。相關(guān)研究顯示，沉默信息調(diào)節(jié)因子6在肺癌組織中高表達(dá)，且能促進(jìn)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，當(dāng)其表達(dá)缺失時(shí)會(huì)使肺癌細(xì)胞周期停留在G1〔7〕；沉默信息調(diào)節(jié)因子2在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑癌的作用〔8〕。沉默信息調(diào)節(jié)因子5定位于線粒體，無(wú)法參與賴氨酸去乙?；^(guò)程，但具有煙酰胺二核糖核苷依賴的丙二?；富钚浴?〕。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)及相關(guān)信號(hào)通路琥珀?；瘯r(shí)，部分代謝信號(hào)通路被破壞，表現(xiàn)為肝臟組織中的酮體分泌量減少和脂肪酸累積量下降〔10〕。沉默信息調(diào)節(jié)因子5參與肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程。人肺癌細(xì)胞中沉默信息調(diào)節(jié)因子5能夠?qū)⑻墙徒獾南匏倜窶2型丙酮酸激酶去琥珀?；?1〕；沉默信息調(diào)節(jié)因子5缺失的細(xì)胞中，當(dāng)限速酶M2型丙酮酸激酶琥珀酰水平增加時(shí)，抑制了丙酮酸激酶活性，下調(diào)沉默信息調(diào)節(jié)因子5表達(dá)，造成肺癌細(xì)胞增殖能力下降〔12〕。非小細(xì)胞肺癌患者中沉默信息調(diào)節(jié)因子5高表達(dá)與不良預(yù)后密切相關(guān)〔13〕。沉默信息調(diào)節(jié)因子5能夠靶向作用于細(xì)胞抗氧化過(guò)程中的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子核因子E2相關(guān)因子2，敲除后能夠抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)〔14〕。沉默信息調(diào)節(jié)因子5表達(dá)上調(diào)能夠抑制異檸檬酸脫氫酶的超琥珀?；?，抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的增殖〔15〕。但沉默信息調(diào)節(jié)因子5在肺癌中的作用及相關(guān)機(jī)制仍未明確。

本研究結(jié)果說(shuō)明，人肺癌細(xì)胞中沉默信息調(diào)節(jié)因子5低表達(dá)可能與肺癌細(xì)胞活性有關(guān)。沉默信息調(diào)節(jié)因子5表達(dá)上調(diào)能夠有效抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，有利于抑制肺癌的發(fā)生與發(fā)展。白細(xì)胞介素6/Stat3是非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞癌干細(xì)胞增殖與更新的關(guān)鍵通路。相關(guān)研究顯示，人肺癌細(xì)胞中沉默信息調(diào)節(jié)因子5去乙?；疭tat3，進(jìn)而抑制線粒體丙酮酸代謝中Stat3的作用〔16〕。本研究結(jié)果提示，Stat3/Nanog信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)沉默信息調(diào)節(jié)因子5介導(dǎo)的肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。Nanog參與調(diào)節(jié)干細(xì)胞增殖，在維持胚胎干細(xì)胞的亞全能性方面發(fā)揮重要作用，可獨(dú)立于LIF/LIFR/ Stat3通路維持早期發(fā)育胚胎中的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、胚胎干細(xì)胞亞全能性，受到了腫瘤研究領(lǐng)域的廣泛關(guān)注〔17〕。本研究結(jié)果提示，默信息調(diào)節(jié)因子5可能通過(guò)調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞的更新和增殖來(lái)調(diào)節(jié)肺癌的發(fā)生與發(fā)展。

綜上，沉默信息調(diào)節(jié)因子5在肺癌細(xì)胞中低表達(dá)，上調(diào)沉默信息調(diào)節(jié)因子5表達(dá)后能夠明顯抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，上述作用可能與抑制Stat3/Nanog信號(hào)通路有關(guān)；沉默信息調(diào)節(jié)因子5有望成為肺癌治療的新靶點(diǎn)。