郭曉波 趙宇峰 趙波 李崗

(長治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院泌尿外科，山西 長治 046011)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤類型，每年有57.3萬新增病例，并導(dǎo)致超過21萬人死亡〔1，2〕。手術(shù)和化療是膀胱癌的主要治療策略，但因其高復(fù)發(fā)率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率，導(dǎo)致治療效果并不理想。因此，亟待尋找新型有效膀胱癌治療方法。微小RNA(miRNA)是非編碼、短鏈、單鏈RNA分子，其通過結(jié)合靶mRNA 3′非翻譯區(qū)來調(diào)節(jié)目標(biāo)蛋白表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)通路，特定miRNA表達(dá)失調(diào)與腫瘤進(jìn)展相關(guān)〔3〕。研究指出miR-141表達(dá)水平與膀胱癌腫瘤分級(jí)、分期及轉(zhuǎn)移、預(yù)后情況存在相關(guān)性〔4，5〕。miR-141靶向runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(RUNX)3調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡〔6〕。溴結(jié)構(gòu)域蛋白(BRD)4是溴域外(BET)蛋白家族成員，其在惡性腫瘤中過度表達(dá)〔7〕。JQ1是一種BRD4選擇性抑制劑，其通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和周期阻滯來抑制膀胱癌等多種實(shí)體瘤進(jìn)展〔8，9〕。本研究探討B(tài)RD4抑制劑JQ1聯(lián)合下調(diào)miR-141對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及潛在分子機(jī)制，以期為臨床治療膀胱癌提供新型策略。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1組織來源 90例膀胱癌組織及與之配對(duì)的癌旁組織取自2018年1月至2019年12月長治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院確診為膀胱癌并行手術(shù)的患者，男72例，女18例，年齡61～80歲，中位年齡70歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未接受抗腫瘤治療；未合并其他惡性腫瘤。所有患者在使用臨床材料前簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2細(xì)胞和試劑 人膀胱癌細(xì)胞RT-4、改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)基、青鏈霉素、胎牛血清購自武漢普諾賽生命科技公司；miScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自德國QIAGEN公司；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒購自美國Roche公司；Annexin V-FITC/碘化丙啶凋亡檢測(cè)試劑盒購自南京凱基生物生物技術(shù)公司；CCK-8試劑盒購自上海吉滿生物科技公司；兔源激活型天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白(caspase)-3單克隆抗體(AC033)、兔源B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2多克隆抗體(AB112)、兔源Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)單克隆抗體(AF1270)、兔源蛋白激酶B(AKT)單克隆抗體(AF1777)、兔源β-actin單克隆抗體(AF5003)購自上海碧云天生物公司；兔源磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)多克隆抗體(ab226826)、羊抗兔二抗(ab205718)、兔源p-PI3K多克隆抗體(ab182651)、兔源p-AKT多克隆抗體(ab38449)購自上海艾博抗生物公司。

1.2RT-qPCR檢測(cè)膀胱癌中miR-141表達(dá) Trizol法提取組織樣本的總RNA，用miScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，根據(jù)熒光定量PCR試劑盒配制反應(yīng)體系進(jìn)行RT-qPCR。U6作為miRNA的內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)和分組 RT-4細(xì)胞接種于含1%青鏈霉素、1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放入含95%空氣、5% CO2、37℃培養(yǎng)箱孵育。在24孔板接種對(duì)數(shù)期RT-4細(xì)胞，Lipo 2000轉(zhuǎn)染anti-miR-141、anti-miR-NC，用Opti-MEM培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)4～6 h后用DMEM培養(yǎng)基代替，收集轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞備用。用不同濃度(0.003 2、0.016 0、0.080 0、0.400 0、0.800 0、2.000 0、10.000 0 μmol/L)的JQ1處理RT-4細(xì)胞48 h，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率，計(jì)算IC50值為0.791，后續(xù)用0.800 0 μmol/L的JQ1進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。正常培養(yǎng)的RT-4細(xì)胞為對(duì)照(Control)組；用含0.800 0 μmol/L JQ1的培養(yǎng)液孵育RT-4細(xì)胞48 h，記為JQ1組；轉(zhuǎn)染anti-miR-141的RT-4細(xì)胞記為anti-miR-141組；用含0.800 0 μmol/L JQ1的培養(yǎng)液孵育轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、轉(zhuǎn)染anti-miR-141的RT-4細(xì)胞48 h，記為JQ1+anti-miR-NC組、JQ1+anti-miR-141組。

1.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 將未轉(zhuǎn)染RT-4細(xì)胞、轉(zhuǎn)染RT-4細(xì)胞分別接種96孔板，根據(jù)1.3分組給予對(duì)應(yīng)劑量的JQ1處理，孵育24、48、72 h時(shí)，用含10% CCK-8試劑的培養(yǎng)液替換原培養(yǎng)液，孵育2 h后，在450 nm處測(cè)量所有樣品的光密度(OD)。

1.5集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆能力 收集各組細(xì)胞并清洗，以1×103個(gè)/孔接種6孔板，培養(yǎng)14～16 d直到出現(xiàn)細(xì)胞集落，用70%乙醇固定細(xì)胞集落，然后用結(jié)晶紫溶液染色。計(jì)數(shù)50個(gè)以上細(xì)胞的集落數(shù)表示為克隆形成數(shù)。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集各組細(xì)胞并清洗，用Annexin V-FITC/碘化丙啶凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡。染色后，所有標(biāo)本立即在FACSort流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)，用Cell Quest3.0軟件分析數(shù)據(jù)。

1.7Western印跡法檢測(cè)PI3K/AKT通路和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞并清洗，將RIPA裂解液加入沉淀中，超聲破碎細(xì)胞，離心吸取上清，獲得蛋白樣品。根據(jù)蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合沸水孵育5 min，使蛋白質(zhì)變性。加樣后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(80 V，30 min；100 V 60 min)，恒定電流轉(zhuǎn)膜(220 mA，60 min)，然后將膜放入含5%脫脂牛奶中封閉1 h。按照抗體說明書稀釋一抗和二抗，在室溫下分別孵育膜2 h。滴適量電化學(xué)發(fā)光(ECL)液于膜上，用凝膠成像儀曝光，通過Image J軟件采集圖像，計(jì)算目的條帶相對(duì)于內(nèi)參β-actin的灰度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-141在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況 膀胱癌組織中miR-141表達(dá)水平(2.33±0.36)顯著高于癌旁組織(1.00±0.12；t=33.250,P<0.000 1)。

2.2BRD4抑制劑JQ1對(duì)膀胱癌細(xì)胞存活率的影響 用不同濃度(0.003 2、0.016 0、0.080 0、0.400 0、0.800 0、2.000 0、10.000 0 μmol/L)的JQ1處理RT-4細(xì)胞48 h，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率分別為(100.00±3.11)%、(95.36±7.22)%、(88.36±7.05)%、(73.47±6.27)%、(49.19±5.23)%、(37.33±4.04)%、(25.19±3.04)%，計(jì)算IC50值為0.791，選擇0.800 0 μmol/L的JQ1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3BRD4抑制劑JQ1聯(lián)合anti-miR-141對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖的影響 與轉(zhuǎn)染anti-miR-NC(1.00±0.12)比較，轉(zhuǎn)染anti-miR-141后RT-4細(xì)胞miR-141表達(dá)(0.24±0.05)顯著降低(P<0.05)，表明轉(zhuǎn)染anti-miR-141可抑制miR-141表達(dá)。與Control組比較，JQ1組、anti-miR-141組RT-4細(xì)胞活力(24 h、48 h、72 h)顯著降低(P<0.05)；與JQ1+anti-miR-141組比較，anti-miR-141組、JQ1組、JQ1+anti-miR-NC組RT-4細(xì)胞活力(48 h、72 h)顯著升高(P<0.05)，見表1。

表1 JQ1聯(lián)合anti-miR-141對(duì)膀胱癌細(xì)胞OD值的影響

2.4BRD4抑制劑JQ1聯(lián)合anti-miR-141對(duì)膀胱癌細(xì)胞菌落形成的影響 Control組、JQ1組、anti-miR-141組、JQ1+anti-miR-NC組、JQ1+anti-miR-141組克隆數(shù)分別為(346.56±41.16)個(gè)、(237.67±16.33)個(gè)、(212.22±28.77)個(gè)、(259.11±28.62)個(gè)、(148.00±13.88)個(gè)；與Control組比較，JQ1組、anti-miR-141組RT-4細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著減少(P<0.05)；與JQ1+anti-miR-141組比較，anti-miR-141組、JQ1組、JQ1+anti-miR-NC組RT-4細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著增加(P<0.05)，見圖1。

2.5BRD4抑制劑JQ1聯(lián)合anti-miR-141對(duì)膀胱癌細(xì)胞凋亡的影響 與Control組比較，JQ1組、anti-miR-141組RT-4細(xì)胞凋亡率及Cl-caspase-3、Bax蛋白水平顯著升高，Bcl-2蛋白水平顯著降低(P<0.05)；與JQ1+anti-miR-141組比較，anti-miR-141組、JQ1組、JQ1+anti-miR-NC組RT-4細(xì)胞凋亡率及Cl-caspase-3、Bax蛋白水平顯著降低，Bcl-2蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見圖2、表2和圖3。

2.6BRD4抑制劑JQ1聯(lián)合anti-miR-141對(duì)膀胱癌細(xì)胞PI3K/AKT通路的影響 蛋白免疫印跡檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)與Control組比較，JQ1組、anti-miR-141組RT-4細(xì)胞p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與JQ1+anti-miR-141組比較，anti-miR-141組、JQ1組、JQ1+anti-miR-NC組RT-4細(xì)胞p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見表2和圖3。

3 討 論

miRNA通過與不同的靶基因結(jié)合參與調(diào)控腫瘤生長、轉(zhuǎn)移等癌癥進(jìn)展多個(gè)環(huán)節(jié)，在人類癌癥防治中具有潛在重要臨床價(jià)值〔10〕。研究報(bào)道肝癌中miR-141表達(dá)下降，上調(diào)miR-141可影響肝癌細(xì)胞周期分布和凋亡，抑制體外增殖活力和遷移能力〔11〕。青藤堿通過下調(diào)lncRNA MALAT1表達(dá)、上調(diào)miR-141表達(dá)來抑制胃癌細(xì)胞惡性表型〔12〕。然而，miR-141在結(jié)腸癌中表達(dá)增加，可能作為癌基因參與結(jié)腸癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程，是結(jié)腸癌早期診斷和基因治療的新靶點(diǎn)〔13，14〕。與之前研究結(jié)果一致〔5，6〕，本研究結(jié)果表明膀胱癌組織中miR-141表達(dá)增加，下調(diào)miR-141表達(dá)可抑制RT-4細(xì)胞增殖活力和克隆形成能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，證實(shí)miR-141在膀胱癌中的致癌功能。BRD4抑制劑JQ1對(duì)多種人類癌癥具有抑制作用，研究報(bào)道JQ1可阻止腎癌細(xì)胞增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)展，誘導(dǎo)caspase-1依賴性細(xì)胞焦亡〔15〕。JQ1通過能力減弱DNA修復(fù)來增加宮頸癌細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感性〔16〕。JQ1聯(lián)合阿霉素能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞生長，并誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡〔17〕。本研究發(fā)現(xiàn)JQ1可抑制RT-4細(xì)胞增殖活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與譚益帆等〔8〕研究結(jié)果吻合。JQ1與下調(diào)miR-141表達(dá)的抗腫瘤作用一致，本研究結(jié)果表明，JQ1聯(lián)合下調(diào)miR-141具有更強(qiáng)的腫瘤抑制作用。Bcl-2家族蛋白通過調(diào)節(jié)線粒體外膜通透性、膜電位喪失水平，誘導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放，促進(jìn)凋亡復(fù)合物形成，激活caspase-9，Cl-caspase-9隨后激活caspase-3，最終誘導(dǎo)凋亡過程〔18，19〕。本研究表明JQ1聯(lián)合下調(diào)miR-141在膀胱癌中協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用。

PI3K/AKT通路在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)中起重要作用，其介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、代謝、凋亡和血管生成等多種生物學(xué)過程〔20，21〕。PI3K/AKT通路的過度激活與膀胱癌細(xì)胞快速生長、腫瘤進(jìn)展和多藥耐藥密切相關(guān)〔20，22〕。研究報(bào)道JQ1通過PI3K/AKT通路誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的周期停滯和凋亡〔23〕。本研究結(jié)果表明，JQ1聯(lián)合下調(diào)miR-141可能通過抑制PI3K/AKT通路協(xié)同發(fā)揮抗膀胱癌作用。

綜上，BRD4抑制劑JQ1聯(lián)合下調(diào)miR-141可抑制膀胱癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT通路有關(guān)。因此，BRD4抑制劑JQ1聯(lián)合下調(diào)miR-141可能是一種潛在有效的膀胱癌治療策略。