李楠洋 吳非 韓斌 王翠芳 欒嵐

(沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 1附屬中心醫(yī)院病理科，遼寧 沈陽(yáng) 110024；2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室；3中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院泌尿外科)

胃癌是當(dāng)今發(fā)病率較高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。本課題組長(zhǎng)期致力于錨蛋白重復(fù)序列6(Diversin)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的相關(guān)研究，前期結(jié)果顯示Diversin在非小細(xì)胞肺癌〔1〕、三陰乳腺癌〔2〕、神經(jīng)膠質(zhì)瘤〔3〕中高表達(dá)。免疫組化結(jié)果顯示，Diversin在胃腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織,Diversin的表達(dá)主要定位于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)與胞膜處〔4〕，且Diversin與胃癌患者的腫瘤直徑、TNM分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)〔5〕。本課題組利用基因芯片技術(shù)分析下調(diào)腫瘤細(xì)胞中Diversin與對(duì)照組中信號(hào)通路及下游靶分子的變化。基因芯片結(jié)果顯示，Diversin可顯著激活腫瘤細(xì)胞的G1/S期檢測(cè)點(diǎn)，這一結(jié)果提示Diversin很可能在胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮重要作用。同時(shí)基因芯片結(jié)果顯示Diversin可以顯著激活Wnt/c-Jun氨基末端激酶(JNK)和ERK-5信號(hào)通路，而研究表明ERK5可以顯著上調(diào)肝癌〔6，7〕、卵巢癌〔8，9〕、前列腺癌〔10，11〕及肺癌〔12〕的淋巴結(jié)黏附功能〔13，14〕，Wnt/JNK信號(hào)通路的激活廣泛存在于非小細(xì)胞肺癌〔14〕、口腔鱗癌〔15〕、三陰乳腺癌〔16〕及食管癌〔17〕中，并且對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后發(fā)揮重要的調(diào)控作用。綜上，Diversin很可能是調(diào)控胃癌淋巴結(jié)黏附甚至是調(diào)控淋巴道轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子之一。本實(shí)驗(yàn)旨在探討Diversin對(duì)胃腺癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化與侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 胃未分化癌細(xì)胞系HGC27和胃中分化癌細(xì)胞系MNK45購(gòu)買于長(zhǎng)沙優(yōu)生物有限公司，RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)買于BI公司。 Diversin過表達(dá)載體GV326質(zhì)粒(Div-GV326)與Diversin shRNA載體GV248質(zhì)粒(Div sh-GV248)由上海吉瑪公司合成。Transwell小室購(gòu)買于millipore公司。結(jié)晶紫染液購(gòu)買于碧云天生物技術(shù)有限公司。Diversin抗體購(gòu)買于Santa Cruz公司，β-actin抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠和山羊抗兔購(gòu)買于碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 人胃腺癌細(xì)胞HGC27和MNK45細(xì)胞系培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)液內(nèi)，同時(shí)將細(xì)胞置于濃度為5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞復(fù)蘇：從液氮中取出HGC27和MNK45細(xì)胞，迅速置于37℃水浴中，使其在1 min內(nèi)完全融化，將細(xì)胞懸液加入15 ml離心管中并加入高壓滅菌過的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞，1 000 r/min，5 min離心后棄上清，加入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液，輕柔吹打混勻，細(xì)胞懸液移至培養(yǎng)瓶中，充分混勻后，將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2，培養(yǎng)12 h后待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，加入高壓滅菌的PBS洗滌細(xì)胞，加入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞傳代：待細(xì)胞接合度達(dá)到80%～90%時(shí)，吸去舊培養(yǎng)液，培養(yǎng)瓶加入高壓滅菌過的PBS洗滌細(xì)胞，加入胰酶消化細(xì)胞1～2 min后加入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液終止消化，吹打混勻細(xì)胞后，將細(xì)胞分裝于新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶加入5 ml含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2。

1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HGC27細(xì)胞和MNK45細(xì)胞用胰酶消化，用加入含有10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化，然后輕柔吹打細(xì)胞成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液均勻接種于6孔板中，每孔約10 000個(gè)細(xì)胞，隨后將6孔板置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞接合度達(dá)到70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。為了上調(diào)Diversin的表達(dá)水平，分別利用轉(zhuǎn)染Diversin過表達(dá)質(zhì)粒Diversin-GV326到HGC27和MNK45細(xì)胞分別作為HGC27上調(diào)組和MNK45上調(diào)組，同時(shí)轉(zhuǎn)染GV326質(zhì)粒到HGC27和MNK45細(xì)胞中分別作為HGC27上調(diào)對(duì)照組和MNK45上調(diào)對(duì)照組。為了下調(diào)Diversin的表達(dá)水平，分別利用轉(zhuǎn)染Diversin sh-GV248質(zhì)粒到HGC27和MNK45細(xì)胞分別作為HGC27下調(diào)組和MNK45下調(diào)組，同時(shí)轉(zhuǎn)染GV326質(zhì)粒到HGC27和MNK45細(xì)胞中分別作為HGC27下調(diào)對(duì)照組和MNK45下調(diào)對(duì)照組，轉(zhuǎn)染Diversin-GV326和Diversin sh-GV248質(zhì)粒的工作濃度分別為250 ng/ml和50 ng/ml。采用攜帶新霉素(G418)抗性標(biāo)簽的GV326過表達(dá)質(zhì)粒和攜帶嘌呤霉素的GV248質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。篩選合適的G418和嘌呤霉素濃度用以維持穩(wěn)定的陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞。利用轉(zhuǎn)染GV326質(zhì)粒構(gòu)建Diversin過表達(dá)載體和GV248質(zhì)粒構(gòu)建Diversin shRNA的RNA干擾質(zhì)粒分別上調(diào)和下調(diào)HGC27和MNK45細(xì)胞中Diversin的表達(dá)水平，并且用含G418濃度為20 μg/ml和40 μg/ml的RPMI1640培養(yǎng)基分別培養(yǎng)HGC27細(xì)胞和MNK45細(xì)胞，含嘌呤霉素濃度為2 μg/ml和3 μg/ml的RPMI1640培養(yǎng)基分別培養(yǎng)HGC27細(xì)胞和MNK45細(xì)胞。

1.4蛋白印跡 將轉(zhuǎn)染72 h的細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，棄去培養(yǎng)基，高壓滅菌的PBS洗滌細(xì)胞，加入胰酶消化細(xì)胞1～2 min后用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞輕柔吹打成細(xì)胞懸液；加入細(xì)胞裂解液〔0.1 mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)pH7.5,20 μmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF),1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),0.1%免疫染色通透液(Triton X)-100〕500 μl吹打細(xì)胞，冰上靜置4 h，12 000 r/min，低溫離心20 min，取上清進(jìn)行蛋白定量。

配制濃縮膠和分離膠濃度分別為5%和12%的聚丙烯酰胺凝膠，每孔加入100 μg用溴酚藍(lán)緩沖液稀釋的樣品，濃縮膠階段采用70 V恒壓電泳，待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到分離膠后將電壓調(diào)至100 V恒壓電泳，待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到局凝膠下緣0.5 cm時(shí)，終止電泳；將凝膠取出，將凝膠中的樣品轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上；用5%脫脂奶粉/TTBS 于室溫封閉2 h,TTBS洗滌3次每次5 min;利用TTBS稀釋一抗Diversin抗體〔Santa Cruz兔抗人 免疫球蛋白(Ig)G〕和β-actin(碧云天 小鼠抗人)稀釋倍數(shù)分別為1∶200和1∶1 000，4℃孵育過夜,TTBS 洗3次每次15 min，二抗(小鼠 IgG Biotin,1∶2 000) 37℃1 h,TTBS 洗滌3次，每次15 min;將 PVDF 膜放入凝膠成像自動(dòng)檢測(cè)儀的暗室中。滴加電化學(xué)發(fā)光(ECL)工作液到膜上，進(jìn)行檢測(cè)，使用Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白和內(nèi)參β-actin 的光密度比值，作為目標(biāo)蛋白的表達(dá)相對(duì)量。

1.5克隆形成實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染72 h的細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，棄去培養(yǎng)基，高壓滅菌的PBS洗滌細(xì)胞，加入胰酶消化細(xì)胞1～2 min后用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞輕柔吹打成細(xì)胞懸液；將各組細(xì)胞分別接種于6孔板內(nèi)，每孔接種細(xì)胞數(shù)為5 000個(gè)，加入1 ml含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基后將6孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每24 h更換一次含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，HGC27細(xì)胞和MNK45細(xì)胞系分別培養(yǎng)48 h和72 h后進(jìn)行觀察；將細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次。將6孔板倒扣在干凈的吸水紙上空干殘留液體。加入37%甲醛溶液，室溫固定10 min，吸去甲醛溶液并空干殘留液體，加入結(jié)晶紫染液0.5 ml室溫染色10 min。染色后吸去結(jié)晶紫染液，PBS洗滌3次，每次10 min，將6孔板倒扣于干凈的吸水紙上空干殘留液體，將6孔板置于燈箱上觀察，計(jì)數(shù)各組染色陽(yáng)性的單克隆個(gè)數(shù)比較各組差異，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6Transwell 將轉(zhuǎn)染72 h的細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，棄去培養(yǎng)基，高壓滅菌的PBS洗滌細(xì)胞，加入胰酶消化細(xì)胞1～2 min后用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞輕柔吹打成細(xì)胞懸液。將Transwell小室(含matrigal)置于24孔板上，用RPMI1640培養(yǎng)基將各組細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，接種于上室，每個(gè)小室接種細(xì)胞數(shù)為500個(gè)；下室加入500 μl 含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，將各組細(xì)胞所在的24孔板至于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中分別孵育HGC27細(xì)胞和MNK45細(xì)胞12 h和24 h。孵育結(jié)束之后將小室取出，用一次性醫(yī)用棉簽拭去上室中的細(xì)胞，然后將小室置于干凈的吸水紙上空吸去殘余液體后置于37%甲醛溶液中固定5 min，然后立即將小室取出置于結(jié)晶紫染液中染色10 min，染色完畢后將小室置于PBS中漂洗洗去多余的結(jié)晶紫溶液，將小室置于新的24孔板中，在放大倍數(shù)為20倍的光鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，通過計(jì)數(shù)成功到達(dá)小室下室的細(xì)胞數(shù)的不同反映各組細(xì)胞侵襲能力的不同，結(jié)果取平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7劃痕試驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染72 h的細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，棄去培養(yǎng)基，高壓滅菌的PBS洗滌細(xì)胞，加入胰酶消化細(xì)胞1～2 min后用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞輕柔吹打成細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液接種于6孔板中每孔不少于2×106個(gè)細(xì)胞，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞重合度達(dá)到95%以上后用記號(hào)筆在6孔板底部劃線標(biāo)記，然后用20 μl Tip頭在垂直于記號(hào)筆標(biāo)記方向?qū)?孔板中細(xì)胞劃痕，然后顯微鏡下拍照記作0 h，將HGC27和MNK45各組細(xì)胞所在的6孔板置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中，于6 h后取出MNK45上調(diào)組與上調(diào)對(duì)照組，12 h后取MNK45下調(diào)組與下調(diào)對(duì)照組，8 h后取出各組HGC27細(xì)胞。在放大倍數(shù)為20倍的鏡下，觀察各組細(xì)胞向劃痕中遷移的趨勢(shì)，并且記錄劃痕兩側(cè)細(xì)胞的距離，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1上調(diào)和下調(diào)HGC27和MNK45細(xì)胞中Diversin表達(dá)水平 HGC27上調(diào)組和MNK45上調(diào)組中Diversin表達(dá)水平分別顯著高于HGC27上調(diào)對(duì)照組和MNK45上調(diào)對(duì)照組(P<0.05)，而HGC27下調(diào)組和MNK45下調(diào)組中Diversin的表達(dá)水平分別顯著低于HGC27下調(diào)對(duì)照組和MNK45下調(diào)對(duì)照組(P<0.05),上述處理方式可較長(zhǎng)時(shí)間維持相應(yīng)細(xì)胞中Diversin的表達(dá)水平。見圖1和表1。

2.2Diversin促進(jìn)胃癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化 HGC27上調(diào)組和MNK45上調(diào)組形成的克隆數(shù)分別顯著高于HGC27上調(diào)對(duì)照組和MNK45上調(diào)對(duì)照組(P<0.05)，而HGC27下調(diào)組和MNK45下調(diào)組形成的克隆數(shù)分別顯著低于HGC27下調(diào)對(duì)照組和MNK45下調(diào)對(duì)照組(P<0.05)。見圖2和表1。

2.3Diversin上調(diào)胃癌細(xì)胞侵襲能力 HGC27上調(diào)組和MNK45上調(diào)組成功到達(dá)Transwell小室下室的細(xì)胞數(shù)分別高于HGC27上調(diào)對(duì)照組和MNK45上調(diào)對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而HGC27下調(diào)對(duì)照組和MNK45下調(diào)對(duì)照組成功到達(dá)Transwell小室下室的細(xì)胞數(shù)分別低于HGC27下調(diào)組和MNK45下調(diào)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3和表1。

2.4Diversin上調(diào)胃癌細(xì)胞的遷移能力 HGC27上調(diào)組和MNK45上調(diào)組劃痕區(qū)域中的細(xì)胞數(shù)分別顯著高于HGC27上調(diào)對(duì)照組和MNK45上調(diào)對(duì)照組(P<0.05)，而HGC27下調(diào)組和MNK45下調(diào)組劃痕區(qū)域中的細(xì)胞數(shù)分別顯著低于HGC27下調(diào)對(duì)照組和MNK45下調(diào)對(duì)照組(P<0.05)。見圖4和表1。

表1 各組Diversin表達(dá)蛋白印跡、克隆形成試驗(yàn)、Transwell和劃痕試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示Diversin可能是促進(jìn)胃癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的因素，為了證實(shí)Diversin參與調(diào)控胃癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的作用，本課題組前期實(shí)驗(yàn)中，基因芯片結(jié)果顯示Diversin的表達(dá)水平可能與腫瘤細(xì)胞中Wnt/JNK信號(hào)通路和ERK信號(hào)通路的活性相關(guān)，研究表明在胃的惡性潰瘍組織中，潰瘍?cè)钪蠾nt/JNK信號(hào)通路靶分子的表達(dá)水平顯著高于正常胃黏膜組織〔18，19〕，其中過表達(dá)核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB的胃未分化癌HGC27細(xì)胞中Wnt/JNK信號(hào)通路的活性顯著升高〔20〕，而經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游靶分子的表達(dá)水平并未顯著升高〔21〕，以上研究結(jié)果提示，在惡性程度較高的胃癌細(xì)胞中Wnt/JNK信號(hào)通路可能發(fā)揮重要的調(diào)控細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的作用。

本研究中Transwell和劃痕試驗(yàn)結(jié)果提示Diversin可能參與調(diào)控胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的初始過程包括黏附和浸潤(rùn)兩個(gè)過程。為了證實(shí)Diversin對(duì)胃癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用，本課題組后續(xù)實(shí)驗(yàn)計(jì)劃利用Diversin穩(wěn)定上調(diào)和穩(wěn)定下調(diào)的胃癌細(xì)胞系開展體外淋巴結(jié)黏附試驗(yàn)，并從mRNA和蛋白水平分析黏附相關(guān)分子黏著斑激酶(FAK)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，CD22等基因的表達(dá)情況，并且利用明膠酶譜分析Diversin對(duì)胃癌細(xì)胞中MMP活性的調(diào)控作用對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行完善。為了更直觀地檢測(cè)Diversin調(diào)控胃癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化與侵襲轉(zhuǎn)移的作用及其機(jī)制，本課題組后續(xù)將對(duì)Diversin穩(wěn)定上調(diào)和穩(wěn)定下調(diào)的胃癌細(xì)胞開展裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步明確Diversin對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和惡性轉(zhuǎn)化過程的調(diào)控作用。同時(shí)有研究表明腫瘤的發(fā)生發(fā)展與免疫細(xì)胞的功能異常有著密切關(guān)系，巨噬細(xì)胞的M2型極化與胃癌、結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展、血管新生、免疫逃逸等生命活動(dòng)密切相關(guān)〔21，22〕，本課題組后續(xù)實(shí)驗(yàn)擬將Diversin穩(wěn)定上調(diào)和穩(wěn)定下調(diào)的胃癌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞或淋巴細(xì)胞進(jìn)行三維共培養(yǎng)并開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，完善Diversin調(diào)控胃癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展過程中信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的研究。