李西棟 紀(jì)雨含 韓富磊 梁亞楠 宓偉

(1臨沂市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，山東 臨沂 276000；2濱州醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與管理學(xué)院)

低度肝臟炎癥反應(yīng)與引發(fā)的胰島素抵抗(IR)和2型糖尿病等代謝性疾病密切相關(guān)〔1〕。有研究表明，肝臟炎癥反應(yīng)是引發(fā)IR的重要機(jī)制〔2〕。促炎癥因子如白細(xì)胞介素(IL)-1α、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6等炎癥因子在脂肪組織中的濃度升高，其在血漿中的濃度也明顯高于正常水平，它們通過激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)、κB抑制蛋白激酶(IKK)-β、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2、蛋白激酶(PK)C、核糖體蛋白S6激酶(S6K)1等炎癥信號，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IR〔3～5〕。長期高脂飲食會(huì)導(dǎo)致胰島素介導(dǎo)的相關(guān)作用減弱，如脂解抑制作用，這時(shí)血漿中游離脂肪酸(FFA)濃度會(huì)明顯升高，促使肝臟生成內(nèi)源性葡萄糖，胰島素不能有效抑制肝糖原的合成，從而導(dǎo)致肝臟發(fā)生IR，引起血糖升高〔6，7〕，肝臟組織是機(jī)體炎癥反應(yīng)和IR的主要器官，因此研究肝臟炎癥反應(yīng)對IR的發(fā)生機(jī)制具有重要意義。山楂原花青素(HPC)是由不同數(shù)量的兒茶素和表兒茶素縮合而成的多酚類低聚化合物，廣泛存在于山楂果中。HPC具有清除自由基、降血壓、降血脂、抗氧化、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性，近年來廣泛用于食品和藥物的開發(fā)〔8〕。維生素C(VC)又稱抗壞血酸，廣泛存在于新鮮蔬菜水果中，是血漿中最有效的抗氧化劑，其與各種氧自由基迅速反應(yīng)，有效清除氧自由基，從而達(dá)到抗氧化的作用〔9〕。本研究探討HPC和VC聯(lián)合用藥對IR模型大鼠肝臟炎癥反應(yīng)的影響及分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠90只，雄性，由濱州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量(190±16)g，6～8周齡，SPF級，合格證號SCXK(魯)2015-0006。適應(yīng)性常規(guī)飼料喂養(yǎng)1 w后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2藥物與試劑 主要藥物及試劑為：羅格列酮(成都恒瑞制藥有限公司，批號H20060578)；HPC(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%，中國西安綠天生物技術(shù)有限公司，批號20150402)；VC(華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號H44020774)；兔抗鼠磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)抗體和兔抗鼠p-PI3K、p-AKT、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB(美國Cell Signaling Technology公司)；兔抗鼠β-actin多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G抗體(美國Millipore公司)；TNF-α、IL-8、IL-4、IL-10、FFA酶聯(lián)名史疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測試劑盒，NE-PERTM試劑盒(美國Millipore公司)；Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix：(Thermo Fisher Scientific)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3儀器 TGL-16M高速冷凍離心機(jī)(上海赫田科學(xué)儀器有限公司)；SpectraMax i3x 多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices)；DYY-6D 電泳儀、DYCZ-24A雙垂直電泳槽(北京六一儀器廠)；RE-5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮儀器廠)；Prism 7500反轉(zhuǎn)錄(RT)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(美國Applied Biosystems公司)；212 PRO凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Kodak公司)；HFJ-25高速勻漿機(jī)(德國Ika公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將90只大鼠隨機(jī)分為對照組(10只)和高脂飲食組(80只)。對照組給予普通飼料(玉米73.5%、麥麩20%、魚粉5%、谷粉1%、食鹽0.5%)，高脂軟食組給予高脂飼料(普通飼料78.8%、膽固醇1%、牛膽鹽0.2%、蛋黃粉10%、豬油 10%)，同時(shí)喂養(yǎng)6個(gè)月，通過尾靜脈測定空腹血糖≥7.0 mmol/L者為造模成功，共造模成功58只〔10〕設(shè)為IR組。造模前后稱體重，檢測兩組造模前后的體重變化。造模后，禁食1夜，次日上午斷尾取血1 ml，檢測大鼠空腹血糖，同時(shí)眼眶靜脈取血，離心取上清，分別檢測血清胰島素水平和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)活性。選取造模成功的50只IR大鼠隨機(jī)分為模型組(0.9%生理鹽水)、HPC(56 mg/kg)組、VC(180 mg/kg)組、HPC(56 mg/kg)+VC(180 mg/kg)組和羅格列酮(2 mg/kg)組各10只。等體積灌胃給藥(20 ml)，每天給藥1次，持續(xù)20 w。

1.5指標(biāo)檢測 最后1次喂養(yǎng)大鼠不禁水但禁食10 h，于眼球取血，4 000 r/min離心8 min，取上清經(jīng)生理鹽水1∶5稀釋后，-20℃低溫保存，并采取大鼠的肝臟組織。參照ELISA試劑盒方法測定血清中的促炎癥因子TNF-α、IL-8和抗炎癥因子IL-8、IL-10的水平；參照ELISA試劑盒的方法測定血清和肝臟中FFA的含量。

1.6蘇木素-伊紅(HE)染色制備肝組織病理切片 取大鼠新鮮肝臟組織，用10%的甲醛溶液固定24 h后石蠟包埋；將修整好的石蠟塊置于石蠟切片機(jī)上連續(xù)切片，片厚約3 μm，置烤箱65℃干燥，貼附30 min；肝組織石蠟切片脫蠟至水：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min，95%、85%、75%酒精各5 min，流水沖洗；蘇木素染色3～5 min，流水沖洗至切片顏色發(fā)藍(lán)，1%鹽酸酒精分化3 s立即取出，流水沖洗，0.5%伊紅復(fù)染10 s，流水沖洗；梯度酒精脫水后中性樹膠封片，晾干，光學(xué)顯微鏡觀察。

1.7Western印跡檢測肝組織PI3K、AKT磷酸化程度和C-NF-κB、N-NF-κB蛋白表達(dá)量 取大鼠新鮮肝臟組織100 mg，用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液清洗兩次，棄掉PBS液，在肝臟組織中加入2 ml的裂解液裂解細(xì)胞，冰浴中低速勻漿提取肝組織中的總蛋白，7 500 r/min離心5 min取上清備用。生理鹽水洗滌肝組織，勻漿，研磨，冰上膨脹裂解15 min，之后震蕩10 s，12 000 r/min，轉(zhuǎn)移上清即胞質(zhì)蛋白。加入生理鹽水到沉淀中，重懸浮細(xì)胞核，冰上裂解20 min，不時(shí)攪動(dòng)，之后12 000 r/min離心10 min，取上清，即為核蛋白，低溫冷凍保存〔11〕。取60 μg總蛋白(包括提取的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核)加入4×蛋白上樣液，使用DYY-6D 電泳儀進(jìn)行電泳分離，電泳分離后將蛋白條帶立即移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，加入含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，按順序依次加入一抗(兔抗鼠PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、NF-κB多克隆抗體，β-actin小鼠多克隆抗體)及相應(yīng)二抗，洗滌后，用電化學(xué)發(fā)光(ECL)系統(tǒng)對相應(yīng)的蛋白條帶進(jìn)行檢測，對底片進(jìn)行曝光、顯影、定影。洗片后，用Quanlity One軟件掃描各蛋白條帶，測定其蛋白灰度值。以β-actin為內(nèi)參對基因的相對表達(dá)量進(jìn)行定量分析，以對應(yīng)的總蛋白對磷酸化蛋白的相對表達(dá)量進(jìn)行半定量分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.8RT-PCR檢測肝組織炎癥因子mRNA的表達(dá) 取小鼠肝臟100 mg，加入600 ml Trizol，低速勻漿破碎細(xì)胞，提取總RNA。將RNA 溶于0.3 ml焦碳酸二乙酯(DEPC)水，取適量稀釋，測定吸光度值A(chǔ)260和A280，并計(jì)算溶解后RNA的純度和含量。取1 μg總RNA在M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的催化作用下逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。cDNA于25 ml的反應(yīng)體系中擴(kuò)增，各反應(yīng)物用量參照Maxima SYBR Green qRT-PCR Master mix說明書要求，反應(yīng)體系包括：cDNA模版6 μl，Maxima SYBR Green qRT-PCR Master mix 12.5 μl，上、下游引物各0.3 μl，超純水5 μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)。目的基因mRNA表達(dá)量均以β-actin mRNA的量作為內(nèi)參校正，將正常對照組定為1個(gè)單位，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。炎癥因子各引物序列為：TNF-α：正向引物：5′-ATCCGCGACGTGGAACTG-3′，反向：3′-ACCGCCTGGAGTTCTGGAA-5′；IL-8正向引物：5′-CAAGGCTGGTCCATGCTCC-3′，反向：3′-CGTTGTCTTTCCTTCACTACTGT-5′；IL-4：正向引物：5′-GCTATTGATGGGTCACCC-3′，反向：3′-AGGACATGGAACTGCAGGAC-5′；IL-10：正向引物：5′-GGTTGCCAAGCCTTATCGGA-3′，反向：3′-TCGTTCCGTCACCTCGTCCA-5′。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1IR大鼠造模結(jié)果 共有58只大鼠造模成功，設(shè)為IR組。與對照組比較，IR組體重顯著升高(P<0.01)，血糖及血清胰島素、ALT、AST和ALP水平均顯著升高(P<0.01)。見表1。

2.2各組血清炎癥因子的檢測結(jié)果對比 與對照組比較，模型組血清中TNF-α 和IL-8水平顯著增加，IL-4和IL-10水平顯著降低(均P<0.01)。與模型組和HPC組比較，HPC+VC組TNF-α和IL-8濃度顯著降低，而IL-4和IL-10濃度顯著升高(均P<0.01)。見表2。

2.3各組血清和肝臟中FFA檢測結(jié)果對比 與對照組比較，模型組血清和肝臟中FFA水平顯著增加(均P<0.01)。與模型組和HPC組比較，HPC+VC組血清和肝臟中FFA濃度顯著降低(均P<0.01)。見表2。

2.4各組肝組織炎性病理反應(yīng)對比 與對照組比較，模型組肝細(xì)胞存在脂肪變性，血管旁存在大量炎癥細(xì)胞浸潤。與模型組和HPC組比較，HPC+VC組脂肪變性明顯減輕，炎細(xì)胞浸潤顯著改善。見圖1。

2.5各組肝組織PI3K、AKT磷酸化程度 與對照組比較，模型組肝組織PI3K、AKT磷酸化程度顯著增加(均P<0.01)；與模型組和HPC組比較，HPC+VC組肝組織PI3K、AKT磷酸化程度顯著降低(均P<0.01)。見圖2、表3。

表3 各組肝組織PI3K磷酸化和AKT磷酸化程度

2.6各組肝組織NF-κB蛋白相對表達(dá)量 與對照組比較，模型組C-NF-κB蛋白表達(dá)量顯著降低，N-NF-κB蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.01)。與模型組和HPC組比較，HPC+VC組C-NF-κB蛋白表達(dá)量顯著增加，N-NF-κB蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.01)。見圖3、表4。

2.7各組肝組織炎癥因子mRNA的表達(dá) 與對照組比較，模型組血清中TNF-α 和IL-8 mRNA相對表達(dá)量顯著增加，IL-4和IL-10 mRNA相對表達(dá)量顯著降低(均P<0.01)。與模型組和HPC組比較，HPC+VC組TNF-α和IL-8 mRNA相對表達(dá)量顯著降低，IL-4和IL-10 mRNA相對表達(dá)量顯著升高(均P<0.01)。見表4。

3 討 論

糖尿病發(fā)生IR時(shí)，各種毒性物質(zhì)、代謝物、微生物易引起肝細(xì)胞損傷、炎性細(xì)胞聚集導(dǎo)致非酒精性脂肪性肝病、肝細(xì)胞性肝癌等系列肝損害〔12，13〕。肝臟炎癥因子水平會(huì)影響胰島素介導(dǎo)的分子信號通路，造成代謝障礙而呈現(xiàn)胰島素敏感性降低〔14〕。

FFA作為一種內(nèi)分泌介質(zhì)，可以有效調(diào)節(jié)胰島素敏感性和糖脂代謝。機(jī)體攝入能量過剩時(shí)，會(huì)在體內(nèi)以脂肪的形式進(jìn)行儲(chǔ)存，若正常的生理不能調(diào)節(jié)這些過多的脂肪時(shí)，大量的FFA從脂肪細(xì)胞中溢出，機(jī)體中異常增多的FFA會(huì)刺激脂肪細(xì)胞釋放TNF-α和IL-8等促炎癥性因子，這些炎癥因子與脂肪細(xì)胞因子的受體和模式識(shí)別受體結(jié)合而干擾機(jī)體中糖脂的正常代謝，使機(jī)體的胰島素敏感性降低，誘發(fā)IR，呈現(xiàn)糖脂代謝紊亂狀態(tài)〔15〕。有研究表明，糖尿病患者發(fā)生肝損傷時(shí)，活性氧簇可誘導(dǎo)肝組織釋放TNF-α和IL-8等促炎癥因子，TNF-α通過干擾線粒體呼吸鏈，并且形成超氧陰離子而增加線粒體膜的通透性，從而加劇線粒體損傷〔16〕；TNF-α可以誘導(dǎo)IL-8的產(chǎn)生，IL-8具有明顯的趨化和激活中性粒細(xì)胞，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，使肝臟炎癥細(xì)胞浸潤更加嚴(yán)重〔17〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HPC+VC可顯著降低血清中促炎因子TNF-α和IL-8的水平，改善炎細(xì)胞浸潤，減輕肝細(xì)胞脂肪變性，降低肝組織損傷程度，調(diào)節(jié)糖脂代謝功能，作用效果優(yōu)于單獨(dú)使用HPC或VC。而IL-4和IL-10屬于抗炎性因子，其對于調(diào)控炎癥反應(yīng)具有重要意義。NF-κB活化可引起眾多炎癥介質(zhì)發(fā)生作用，活化后的NF-κB由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，影響TNF-α和IL-8等基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，誘發(fā)各種炎癥反應(yīng)，活化的PI3K/AKT/NF-κB信號通路可直接或間接促進(jìn)肝臟炎癥的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果說明HPC+VC能有效阻斷PI3K/AKT/NF-κB信號通路、抑制NF-κB活化，進(jìn)而降低TNF-α、IL-8的濃度，改善肝臟炎癥損傷?？梢酝茰yHPC+VC聯(lián)合用藥可能通過PI3K/AKT/NF-κB分子信號通路改善IR大鼠的肝臟炎癥反應(yīng)，又因?yàn)镠PC和VC均為食物中的天然營養(yǎng)成分，無毒副作用，有一定的藥物開發(fā)和研究價(jià)值。

綜上，HPC+VC聯(lián)合用藥可明顯改善IR大鼠的肝臟炎癥反應(yīng)，但HPC+VC用藥后如何作用于受體來調(diào)控PI3K/AKT/NFκB分子信號通路，目前分子機(jī)制還不清楚，還需進(jìn)一步研究。