趙偉新 王朋飛 夏貴山 敬廣霞

(鄭州市中心醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

糖尿病治療不當(dāng)會(huì)引起一系列糖尿病慢性并發(fā)癥，危害機(jī)體心臟、大腦、腎臟等多個(gè)器官〔1,2〕。糖尿病腦病是公認(rèn)的一種糖尿病慢性并發(fā)癥，即由糖尿病代謝紊亂引起的中樞神經(jīng)損傷〔3〕。糖尿病腦病主要導(dǎo)致語言、認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)功能障礙，臨床表現(xiàn)為短期記憶缺陷、理解能力下降、行動(dòng)遲緩等〔4,5〕。目前有研究報(bào)道糖尿病腦病與海馬神經(jīng)元凋亡具有密切關(guān)系〔6〕，因此尋找一種有效抑制海馬神經(jīng)元凋亡的藥物對于糖尿病腦病的深入研究具有非常重要的意義。右美托咪定是一種α2-腎上腺素受體激動(dòng)劑，具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抑制交感神經(jīng)活性等作用〔7〕，近年來有研究顯示右美托咪定也具有神經(jīng)保護(hù)作用〔8〕。本文擬對右美托咪定在高糖誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷中是否具有保護(hù)作用及機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑儀器 SPF級SD大鼠10只購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，體重5～10 g，雌雄各半，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2019-0009；控制SPF屏障內(nèi)溫度為20～25℃，濕度為50%～70%。本實(shí)驗(yàn)室對SD大鼠的處理符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利及倫理規(guī)范。

DMEM培養(yǎng)液(31600034)、胎牛血清(FBS)(16000-044)、胰蛋白酶(25200-056)等購自Gibco公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)(CCK)-8試劑盒(4020ES60)購自上海翊圣生物科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(PT0001)購自北京雷根生物技術(shù)有限公司；TUNEL檢測試劑盒(C1088)、Hoechst 染色液(C1018)購自碧云天生物技術(shù)有限公司；總蛋白提取試劑盒(78510)購自Thermo公司；GAPDH單抗(ab181602)、神經(jīng)元特異核蛋白(NeuN)抗體(ab104224)、突觸素(SYP)抗體(ab184176)、活化胱天蛋白酶(cleaved cas)-3抗體(ab13847)、B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2抗體(ab182858)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體(ab32503)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白抗體(ab38449)、Akt蛋白抗體(ab18785)、磷酸化信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(p-STAT3)蛋白抗體(ab76351)、STAT3蛋白抗體(ab119352)等兔源多抗及異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗兔熒光二抗(ab6717)和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(ab6721)均購自Abcam。

倒置熒光顯微鏡(Olympus IX70)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf centrifuge,5415R)；PCR儀(Bio-Rad,S1000)；超低溫冰箱(HISENSE)；蛋白凝膠成像儀(Thermo)；細(xì)胞恒溫CO2培養(yǎng)箱(SANYO)；其他常規(guī)儀器均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2原代大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng) 脫頸處死出生24 h內(nèi)的SD大鼠，置于75%酒精中浸泡消毒10 min，置于冰盒上操作。分層剪開頭部皮膚和顱骨，暴露雙側(cè)大腦，用眼科鑷分開大腦皮層，暴露雙側(cè)海馬組織，分離出新月形海馬組織后置于事先加入預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，剔除海馬組織中血管和腦膜組織后，將其剪成1 mm3的小碎塊，隨后轉(zhuǎn)移至2 ml離心管中，加入胰蛋白酶置于37℃培養(yǎng)箱中消化10 min，期間振蕩2～3次，待消化液變渾濁且不見組織塊時(shí)終止消化。1 500 r/min離心5 min，棄上清液，加入2 ml DMEM培養(yǎng)液再次離心5 min，棄上清液后用加入10%FBS及雙抗的DMEM培養(yǎng)液重懸沉淀，輕輕吹打混勻，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后更換全部培養(yǎng)液，之后每2～3 d進(jìn)行半量換液培養(yǎng)。

1.3免疫熒光試驗(yàn)鑒定海馬神經(jīng)元 待海馬神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)至第12天時(shí)，將其接種至24孔板中(孔內(nèi)提前放入爬片)培養(yǎng)24 h后對其進(jìn)行鑒定。棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，預(yù)冷的4%多聚甲醛固定30 min后，PBS再?zèng)_洗3次，加入預(yù)冷的甲醇室溫透化10 min，PBS再?zèng)_洗3次，加入5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉45 min，棄掉封閉液，加入1∶1 000稀釋的NeuN單抗，室溫孵育1 h，回收一抗后PBS沖洗3次，加入1∶5 000稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗兔熒光二抗避光孵育1 h，棄二抗，加入1∶500稀釋的鬼筆環(huán)肽，37℃孵育50 min，PBS清洗3次，加入1 μg/ml的DAPI染料，避光作用15 min，棄掉DAPI，PBS沖洗3次，最后加入少許PBS，將爬片轉(zhuǎn)移至載玻片上置于熒光顯微鏡下觀察。

1.4CCK-8試驗(yàn) 分組及處理：制備海馬神經(jīng)元細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液隨機(jī)分為3組，參考相關(guān)文獻(xiàn)〔9〕分別給予100 mmol/L葡萄糖處理(高糖組)、400 μmol/L右美托咪定與100 mmol/L葡萄糖共同處理(高糖+右美托咪定組)及不做任何處理(對照組)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。分別制備各組細(xì)胞懸液并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞懸液加入96孔板中，每孔加100 μl，用培養(yǎng)液做10倍倍比稀釋，共設(shè)置5個(gè)細(xì)胞濃度梯度，同時(shí)每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h。向每孔中加入10 μl CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～4 h，置于酶標(biāo)儀中測定其在450 nm波長處的吸光度。

1.5TUNEL試驗(yàn) 分組及處理方法同1.4，分組處理24 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。首先進(jìn)行Hoechst活細(xì)胞染色，將各組處理后的細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，將106個(gè)細(xì)胞懸浮于1 ml含有10%FBS的培養(yǎng)液中，加入10 μl Hoechst 染色液混勻后置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 min，將細(xì)胞置于冰上冷卻，4℃離心后棄上清，將細(xì)胞用培養(yǎng)液重懸接種于24孔板中(提前放入爬片)，進(jìn)行后續(xù)TUNEL染色。

參照TUNEL檢測試劑盒說明書進(jìn)行試驗(yàn)。待細(xì)胞長滿爬片的70%～80%后取出爬片，室溫晾干固定20 min，PBS沖洗3次，每次5 min。封閉液室溫封閉10 min，PBS洗滌3次，每次5 min。通透液室溫透化2 min，在濕盒中進(jìn)行后續(xù)標(biāo)記反應(yīng)。PBS沖洗細(xì)胞爬片并用濾紙吸干周圍洗液，每個(gè)樣本加入100 μl末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)酶反應(yīng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育60 min。20×檸檬酸鈉緩沖液(SSC)終止反應(yīng)，室溫靜置15 min，PBS沖洗3次，每次5 min。將爬片置于0.3%H2O2/PBS中室溫封閉5 min，PBS沖洗3次。加入100 μl HRP標(biāo)記的鏈霉素和素(Streptavidin-HRP)工作液，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育60 min，PBS沖洗3次。加入3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液，去離子水沖洗數(shù)次后用中型樹膠封片，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.6免疫熒光試驗(yàn)檢測SYP蛋白表達(dá) 分組及處理方法同1.4，分組處理24 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。免疫熒光試驗(yàn)封閉操作前的具體方法同1.3，封閉后加入1∶1 000稀釋的兔源SYP多抗，室溫孵育1 h，回收一抗后PBS沖洗3次，加入1∶5 000稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗兔熒光二抗避光孵育1 h，棄二抗，PBS清洗3次，加入1 μg/ml的DAPI染料，避光作用15 min，棄掉DAPI，PBS沖洗3次，最后加入少許PBS，將爬片轉(zhuǎn)移至載玻片上置于熒光顯微鏡下觀察。

1.7實(shí)時(shí)熒光定量(qRT)-PCR檢測mRNA表達(dá) 分組及處理方法同1.4，分組處理24 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種至6孔板中，細(xì)胞接種量為2.5×105個(gè)細(xì)胞。通過Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參，通過 法計(jì)算SYP mRNA相對表達(dá)量。具體引物序列：SYP上游引物：5′TCCAATCAGATGTAGTCTGGTCAG3′、下游：5′AGGCCTTCTCCTGAGCTCTT3′；GAPDH上游引物：5′AGAAGGCTGGGGCTCATTTG3′、下游：5′AGGGGCCATCCACAGTCTTC3′。

1.8Western印跡檢測蛋白表達(dá) 分組及處理方法同1.4，分組處理24 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。按照總蛋白提取試劑盒說明書操作提取細(xì)胞總蛋白，利用BCA試劑盒測定蛋白濃度，蛋白定量后渦旋混勻，置于沸水浴中煮樣10 min，存放于-80℃?zhèn)溆?。配制十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳時(shí)濃縮膠電壓為90 V，分離膠電壓為120 V，電泳結(jié)束后采用恒流轉(zhuǎn)印，將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，轉(zhuǎn)印條件為恒流250 mA，1～2 h。轉(zhuǎn)膜后TBST洗膜3次，5%脫脂乳封閉1 h，分別加入GAPDH單抗、SYP、cleaved cas-3、Bcl-2、Bax、p-Akt、Akt、p-STAT3和STAT3的兔源多抗，稀釋倍數(shù)均為1∶1 000，室溫孵育4～6 h，TBST洗膜3次，每次5 min。加入1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記二抗室溫?fù)u床孵育2 h，TBST洗膜3次，每次5 min。顯色液顯色，置于蛋白凝膠成像儀下分析目的蛋白的相對含量。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1海馬神經(jīng)元的鑒定 原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元采用NeuN蛋白進(jìn)行特異性標(biāo)記，免疫熒光結(jié)果顯示，NeuN蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞核，且NeuN呈強(qiáng)陽性蛋白，表達(dá)強(qiáng)度為(93.21±3.01)%。見圖1。

2.2右美托咪定抑制高糖誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞活力的降低 與對照組〔(102.77±5.19)%〕相比，高糖組神經(jīng)元細(xì)胞的存活率顯著降低〔(70.59±6.75)%，P<0.05〕；與高糖組比較，高糖+右美托咪定組神經(jīng)元細(xì)胞的存活率〔(89.27±5.19)%，P<0.05〕顯著升高。

2.3右美托咪定抑制高糖誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡 與對照組〔(4.02±0.98)%〕相比，高糖組神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率〔(28.12±3.71)%，P<0.05〕顯著升高；與高糖組比較，高糖+右美托咪定組神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡率〔(11.30±2.04)%，P<0.05〕顯著降低。見圖2。與對照組相比，高糖組神經(jīng)元細(xì)胞cleaved cas-3、Bax蛋白顯著升高,Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與高糖組比較，高糖+右美托咪定組神經(jīng)元細(xì)胞cleaved cas-3、Bax蛋白顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見表1、圖3。

2.4右美托咪定促進(jìn)突觸素蛋白和mRNA表達(dá) 與對照組相比，高糖組神經(jīng)元細(xì)胞SYP蛋白及mRNA顯著降低(P<0.05)；與高糖組比較，高糖+右美托咪定組神經(jīng)元細(xì)胞SYP蛋白及mRNA顯著升高(P<0.05)。見表1、圖4、圖5。

2.5右美托咪定激活PI3K/Akt和JAK2/STAT3信號通路 與對照組相比，高糖組神經(jīng)元細(xì)胞p-Akt和p-STAT3蛋白顯著降低(P<0.05)；與高糖組比較，高糖+右美托咪定組神經(jīng)元細(xì)胞p-Akt和p-STAT3蛋白顯著升高(P<0.05)。各組Akt和STAT3蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1、圖6。

3 討 論

糖尿病腦病與海馬神經(jīng)元損傷密切相關(guān)，具體表現(xiàn)為高糖可導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂、血液黏稠度升高、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷等〔10,11〕，進(jìn)而引發(fā)大腦供血不足，造成與認(rèn)知有關(guān)的大腦海馬神經(jīng)元損傷〔12〕。臨床上對于糖尿病腦病所引起的神經(jīng)元損傷治療大多以藥物控制為主，但目前所用的藥物存在較為嚴(yán)重的副作用。右美托咪定是一種主要作用于神經(jīng)系統(tǒng)的藥物，臨床上多與鎮(zhèn)靜藥物等聯(lián)合使用進(jìn)行麻醉，具有良好的抑制交感神經(jīng)活性作用〔13〕，且近期有研究顯示右美托咪定對神經(jīng)性疾病具有良好的治療效果〔14〕。本研究表明右美托咪定能有效抑制高糖誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性降低和細(xì)胞凋亡，對于高糖誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用。

cas-3蛋白是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，cleaved cas-3是其活化后被剪切產(chǎn)生的活性片段，具有蛋白水解酶的作用，能夠促使細(xì)胞凋亡〔15〕。Bcl-2家族在調(diào)控細(xì)胞凋亡過程中具有重要作用，Bcl-2蛋白是抗凋亡基因，可降低細(xì)胞內(nèi)氧化還原電位從而抑制細(xì)胞凋亡〔16〕。Bax則是凋亡促進(jìn)基因，可以和Bcl-2結(jié)合形成二聚體抑制Bcl-2的抗凋亡作用〔17〕。本研究表明右美托咪定具有對抗高糖引起的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的作用。

SYP是主要存在于海馬神經(jīng)元突觸前膜的囊泡中的一種糖蛋白，與突觸功能和結(jié)構(gòu)密切相關(guān)〔18,19〕。據(jù)報(bào)道，SYP表達(dá)能夠反映突觸的再生和重構(gòu)能力，神經(jīng)元損傷后導(dǎo)致突觸功能異常或喪失，進(jìn)而引發(fā)嚴(yán)重的認(rèn)知功能障礙〔20〕。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了右美托咪定能夠抑制高糖導(dǎo)致的大鼠海馬神經(jīng)元損傷。

有研究報(bào)道，某些藥物治療對腦損傷具有保護(hù)作用，而該過程是在PI3K/Akt信號通路激活的參與下完成的，其中的機(jī)制為：抑制Akt蛋白的磷酸化能夠加重神經(jīng)元損傷患者的認(rèn)知和記憶損傷，反之，促進(jìn)Akt蛋白磷酸化則能顯著抑制信號通路中Bax蛋白的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生〔21〕。JAK2/STAT3信號通路是一條參與細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥等多個(gè)生理和病理過程的重要信號通路〔22〕，李霞等〔23〕觀察STAT3被激活后能夠有效抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，當(dāng)JAK2/STAT3信號通路受到抑制且STAT3磷酸化被干擾時(shí)會(huì)加重神經(jīng)元損傷。本研究結(jié)果表明，應(yīng)用右美托咪定后，PI3K/Akt和JAK2/STAT3信號通路被激活并增加p-Akt和p-STAT3表達(dá)量，但右美托咪定是否通過這兩條信號通路發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞作用及這兩條信號通路的具體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和通路間的相互關(guān)系還需深入研究。

綜上，右美托咪定對高糖誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用，右美托咪定可以激活PI3K/Akt和JAK2/STAT3信號通路，推測右美托咪定可能通過激活PI3K/Akt和JAK2/STAT3信號通路對高糖誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元損傷發(fā)揮保護(hù)作用。