張偉波 吳麗潔 高原 溫佩彤 壽崟 王曉南 徐平

(1浙江省立同德醫(yī)院，浙江 杭州 310013；2浙江省中醫(yī)院；3浙江省康復醫(yī)院；4上海市第八人民醫(yī)院；5上海中醫(yī)藥大學；6上海第一人民醫(yī)院；7美國埃默里大學醫(yī)學院)

Model evaluatron of aging-induced skeletal muscle atrophy in SD rats

ZHANG Wei-Bo, WU Li-Jie, GAO Yuan,etal.

Zhejiang Province Iongde Hospital,Hangzhou 310013,Zhejiang,China

【Abstract】ObjectiveTo observe the gastrocnemius wet weight of the body mass ratio, gastrocnemius microstructure morphology, age-related indicators of superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) content, myogenic regulator 〔myogenic biochemical factor (MyoD), muscle satellite cell (Myogenin)〕 with the change of different months rats, then evaluate the morphology and related protein expression in rats skeletal muscle of different rats,to provide reference for the study of skeletal muscle model atrophy in SD rats with natural aging.Methods56 normal male SD rats were randomly divided into 6, 8, 12, 14, 16, 18 and 20-month-old group. They were fed with natural diet. At the corresponding age of month, two sides of gastrocnemius muscle and blood were taken. After weighing gastrocnemius muscle wet weight, the ratio to the body weight was calculated. After blood centrifugation, the content of SOD and MDA in muscle and serum and the expression of MyoD and Myogenin in muscle were measured.ResultsAfter the age of 14 months, the mortality of rats increased gradually with aging.Morphologically, compared with the age of 6 months, the gastrocnemius muscle of the rats at the age of 8 months had not significant atrophy. After the age of 12 months, the gastrocnemius muscle of the rats showed significant atrophy, skeletal muscle cells showed mild degenerative changes. With the increase of age, the gastrocnemius muscle atrophy and muscle fiber senescence necrosis became more obvious. The gastrocnemius muscle of rats showed obvious atrophy and degenerative changes after the age of 12 months, which could meet the requirements of modeling. SOD activity in gastrocnemius muscle and serum of the rats at the age of 12 months was not significantly different from that of the rats at the age of 8 months(P>0.05), it decreased significantly at the age of 14 months, and SOD activity decreased more obvious with the increase of the age (allP<0.05). MDA content in serum and gastrocnemius muscle did not increase significantly at the age of 12 months(P>0.05). At the age of 14 months, MDA content increased significantly, and with the increase of months, MDA content increased more significantly(allP<0.05). Compared with 8-month-old group, there was no significant difference in the expression of MyoD in gastrocnemius muscle between 12-month-old and 14-month-old group(P>0.05),but the expression of MyoD was significantly decreased in 16,18 and 20-month-old groups(P<0.05). The expression of Myogenin decreased with age increasing. Compared with 8-month-old group, the expression of Myogenin in other groups were significantly different(P<0.05). The natural aging could mainly affect the expression of Myogenin, except the expression of MyoD at the age of 12～14 months.ConclusionsThe better modeling time for the aging model of natural aging rats with skeletal muscle atrophy is the age of 12～16 months, during which skeletal muscle atrophy is obvious and feeding time is moderate, which could not only save modeling time and experimental cost, but also guarantee the success rate of modeling.

【Keywords】 Aging; Aging skeletal muscle atrophy; Animal model

疾病動物模型在生物醫(yī)學研究中至關重要，是開展生物醫(yī)學研究的前提條件，好的疾病動物模型需要盡可能地模擬人類疾病的發(fā)病機制和臨床表現(xiàn)，滿足發(fā)病機制的同源性、行為表象的一致性、藥物治療的可預見性〔1〕，這是動物模型應用的前提，同時，造模方法是否簡單易行、是否可重復、死亡率、經(jīng)濟性等都是評價一個動物模型優(yōu)劣的重要方面。增齡性骨骼肌萎縮是在衰老的過程中發(fā)生的一種運動功能逐漸衰退的疾病，與衰老的關系密切，模型的選擇也大多采用衰老相關的動物模型，主要分為自發(fā)性動物模型、誘發(fā)性動物模型和轉基因動物模型〔2〕，迄今為止尚未有任何一種動物模型可以完美復制人類衰老過程〔3〕，但自發(fā)性動物模型中的自然衰老模型最能接近人體自然衰老的生理病理特點，是較為理想的動物模型。在臨床研究當中，增齡性骨骼肌萎縮的診斷一直缺乏明確的標準，但骨骼肌質量伴隨著功能的逐漸喪失在該疾病的診斷中已達成共識〔4～7〕，參照人流行病學的調查研究，選擇一個造模效果好的動物模型十分必要，而且，與自然衰老相關的原發(fā)性增齡性骨骼肌萎縮也是這一領域的主要研究重點，在衰老機制研究中應用廣泛，本文主要觀察自然衰老SD大鼠腓腸肌的濕重體重比及微觀組織形態(tài)變化、衰老相關指標超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量、生肌調節(jié)因子〔成肌生化因子(MyoD)、肌肉衛(wèi)星細胞(Myogenin)〕的變化情況，評估不同月齡大鼠造模的特點。

1 材料與方法

1.1動物及設備 6月齡SPF級雄性SD大鼠，56只，體重(490±25)g，由西普爾-畢凱實驗動物有限公司提供〔SCXK(滬)2014-0008〕，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級設施〔SYXK(滬)2004-0005〕。

1.2實驗分組 隨機分為6月齡組、8月齡組、12月齡組、14月齡組、16月齡組、18月齡組、20月齡組，具體如下：動物適應性飼養(yǎng)1 w后，剔除疾病、意外死亡等不符合實驗要求者，按體重由輕到重的順序，分為8個區(qū)組，每組7只，再將每個區(qū)組按照隨機數(shù)字表法隨機分到7個組中。

1.3動物干預方法 正常飼養(yǎng)，自由飲水和攝取食物(國家標準嚙齒類動物常規(guī)飼料)。

1.4取材方法 于對應月齡當天禁食，次日測量體重后，用5%戊巴比妥鈉麻醉后，仰臥位鼠板固定，迅速剝離雙側的腓腸肌，用電子天平稱重并記錄。將左側腓腸肌剪裁約1 cm ×1 cm ×1 cm，于4%多聚甲醛溶液內固定，待取材完畢，梯度脫水后用石蠟進行包埋，用于形態(tài)學蘇木素-伊紅(HE)染色觀察，將右側腓腸肌用錫紙包裹標記后放于液氮中保存，用于Western印跡檢測備用，心尖取血5 ml，用臺式離心機分離血清后，置于-80℃的恒溫冰箱內備用。

1.5指標檢測 肌肉獲取前稱量體重，計算肌肉濕重與體重之比。 采用常規(guī)石蠟切片，對比目魚肌分別進行HE染色；采用OLYMPUS CX21型光學顯微鏡觀察骨骼肌形態(tài)記錄并保存，然后用Mic image pro2.0對保存的圖像進行分析。按照試劑盒說明對其中的SOD活力及MDA含量進行檢測并記錄。采用常規(guī)Western印跡法檢測骨骼肌相關蛋白表達，包括MyoD和Myogenin。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1大鼠的取材及死亡情況 大鼠8月齡組死亡0只，12月齡組死亡1只，14月齡組死亡1只，16月齡組死亡2只，18月齡組死亡3只，20月齡組死亡4只，提示隨著月齡的增加，大鼠的死亡率逐漸升高。

2.2各組腓腸肌的濕重體重比變化 與6月齡相比，8月齡大鼠濕重體重比出現(xiàn)下降，但差異并不顯著(P>0.05)，自12月齡之后，腓腸肌的濕重體重比明顯下降(均P<0.05)，且隨月齡增加有加重的趨勢，到16月齡時，約為6月齡的73%。見表1。

表1 各組體重及腓腸肌濕重體重比

2.3各組腓腸肌橫斷面HE染色 8月齡組顯示為正常的骨骼肌組織學特征，肌纖維排列整齊、緊密，細胞膜邊界清晰，無肌質淡染細胞，其橫斷面呈多角形，大小均勻，細胞核為多個，均位于細胞膜處，呈橢圓形；12月齡組出現(xiàn)輕度骨骼肌退行性病變，少見肌質淡染細胞，部分樣本肌纖維橫斷面出現(xiàn)細胞核中心化(細胞核向細胞中心聚集)的現(xiàn)象，少見角化的肌纖維。14月齡組肌纖維排列尚緊密，大小尚均勻，細胞邊界圓潤，核內移現(xiàn)象較多，多見角化、壞死的肌纖維。16月齡組肌纖維的排列疏松，細胞的圓形化、小角化、細胞核的中心化及肌纖維壞死現(xiàn)象進一步加重，肌纖維細胞外基質增多，大小尚均勻，少見肌質淡染細胞，肌纖維的小角化現(xiàn)象多見，可見壞死被吞噬的肌纖維。18月齡組肌纖維的排列疏松，細胞的圓形化、小角化、細胞核的中心化及肌纖維壞死現(xiàn)象進一步加重。20月齡組肌纖維的排列疏松，肌纖維周邊有空泡，肌質淡染，肌纖維的橫斷面大小差異較大，圓形化、小角化、細胞核的中心化現(xiàn)象進一步加重，壞死被吞噬的肌纖維多見。見圖1。

2.4血清及腓腸肌SOD活力和MDA含量比較 與8月齡比較，12月齡大鼠血清及腓腸肌中的SOD活力未明顯下降(P>0.05)，到14月齡時才明顯下降，而且隨著月齡增加，SOD活力下降越明顯(均P<0.05)；血清及腓腸肌中MDA含量12月齡升高不明顯(P>0.05)，到14月齡時MDA含量升高顯著，隨著月齡的增加，MDA含量升高越明顯(均P>0.05)。見表2。提示大鼠腓腸肌的衰老伴隨著整體的衰老同時發(fā)生。

2.5腓腸肌中MyoD和Myogenin的表達量比較 腓腸肌中MyoD的表達，與8月齡組(0.66±0.18)比較，12、14月齡組(0.68±0.15、0.51±0.13)沒有明顯的統(tǒng)計學差異(P>0.05)，16、18、20月齡MyoD表達(0.45±0.12、0.41±0.09、0.38±0.13)明顯降低(均P<0.05)；8、12、14、16、18、20月齡組Myogenin 表達分別為：0.72±0.08、0.66±0.04、0.63±0.08、0.53±0.05、0.49±0.08、0.46±0.12，且隨著月齡增加逐漸降低，與8月齡組比較，其余各組Myogenin 表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示12～14月齡,自然衰老主要影響Myogenin的表達，而對MyoD的表達影響并不明顯。見圖2。

3 討 論

衰老是不可逆的，是機體發(fā)育成熟后的一個必然過程，也是增齡性骨骼肌萎縮發(fā)生的主要因素〔8〕，骨骼肌作為人體最大的運動和內分泌器官，它儲存著人體60%的蛋白質，有研究顯示，骨骼肌的質量和力量會在成年早期達到峰值〔9〕，之后便開始出現(xiàn)萎縮，在人體的研究中發(fā)現(xiàn)，從30歲開始，骨骼肌的相對質量開始下降，而骨骼肌絕對質量的顯著下降要到50歲時才被觀察到〔10〕。本研究結果說明，隨著月齡的增加，肌纖維衰老的表現(xiàn)越來越明顯。

除形態(tài)學的表現(xiàn)外，SOD和MDA也是反映衰老的重要指標。SOD具有重要的抗氧化功能，可以減少活性氧(ROS)的堆積，防止ROS對細胞造成損傷，這種“自由基衰老學說”最早由Denham Harman在1956年的時候提出〔11〕，研究證明，過氧化物堆積能夠促進骨骼肌的萎縮〔12〕，MDA是一種具有高活性的化合物，主要來自多不飽和脂肪酸的脂質過氧化作用〔13〕，在生物體內，多是細胞膜上的脂質被氧自由基氧化的最終產(chǎn)物，常被用來檢測脂質的過氧化程度，以間接測定膜系統(tǒng)的受損程度，并且MDA在細胞中能引起毒性反應，常被作為衡量生物氧化應激水平的標志〔14〕。本研究結果骨骼肌的衰老與整體的衰老關系密切。參照秦川〔15〕的醫(yī)學實驗動物學，其中6～12月齡正好是大鼠的成年期。由此可見，在成年期之后，大鼠衰老的同時，骨骼肌也出現(xiàn)了明顯的衰老跡象，近年來，也有人將增齡性骨骼肌萎縮作為預測衰老死亡的一個重要指標〔4〕。因此，12月齡的大鼠，其肌肉和整體的衰老表現(xiàn)并不明顯，若研究骨骼肌萎縮與衰老相關方面的研究，建議采用14月齡以后的大鼠。

骨骼肌的萎縮與運動單位數(shù)量和大小有關〔7，8，16〕，其中與MyoD和Myogenin的關系密切，也是決定骨骼肌萎縮的重要因素。MyoD和Myogenin是骨骼肌的正向調控因子〔17，18〕，屬于生肌調節(jié)因子(MRFs)家族的成員〔19〕，能調節(jié)基因的轉錄〔20〕，在肌肉的生長、發(fā)育過程中起著重要作用，其中，MyoD可以激活肌衛(wèi)星細胞向成肌細胞轉化，促進成肌細胞轉化為成熟的肌纖維，Myogenin能夠促進成肌細胞分化成肌小管，在肌肉的分化過程中起著關鍵作用。本研究16月齡前，自然衰老主要影響肌衛(wèi)星細胞能否正常分化為肌小管，而對肌衛(wèi)星細胞自身的增殖影響并不明顯。

一個動物模型的好壞，是直接影響科研效率和科研效果的重要因素，綜上所述，增齡性大鼠骨骼肌萎縮自然衰老模型較佳的造模時間為 12～16月齡，如單純研究某種干預措施對骨骼肌萎縮形態(tài)方面的影響，12月齡的大鼠已經(jīng)可以滿足相關需求，若研究骨骼肌萎縮與衰老相關方面的研究，建議采用14～16月齡的大鼠，其骨骼肌和整體衰老的指標相對明顯，可見，根據(jù)實驗目的選擇不同月齡的大鼠模型，既可以規(guī)避高月齡大鼠高死亡率的風險，又能夠節(jié)約造模時間和實驗成本，提高科研效率。