楊勇 何開強(qiáng) 文云波

(遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院(遵義市第一人民醫(yī)院)肛腸科，貴州 遵義 563000)

直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，全球每年新發(fā)直腸癌病例約600萬(wàn)，發(fā)病率和死亡率均位居前列〔1〕。老年人是直腸癌的高發(fā)群體，存在較多的基礎(chǔ)疾病，加之直腸癌起病隱匿，早期癥狀不典型，多數(shù)患者確診時(shí)已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移〔2〕。相關(guān)研究顯示，壁外血管侵犯是直腸癌轉(zhuǎn)移、局部復(fù)發(fā)、不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素〔3〕。術(shù)前準(zhǔn)確評(píng)估直腸癌患者壁外血管侵犯情況對(duì)治療方案的制定具有重要價(jià)值。目前臨床主要采用磁共振成像進(jìn)行直腸癌術(shù)前壁外血管侵犯的評(píng)估，但準(zhǔn)確性仍需進(jìn)一步提升〔4〕。直腸腔內(nèi)三維超聲主要用于評(píng)估直腸癌患者的T分期和N分期，評(píng)估壁外血管侵犯的相關(guān)研究仍十分少見。脆性組氨酸三聯(lián)體(FHIT)基因在胃癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中存在異常表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)〔5〕。凋亡抑制蛋白Apollon過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展〔6〕。本研究旨在探討直腸腔內(nèi)三維超聲聯(lián)合FHIT、Apollon 蛋白對(duì)老年直腸癌患者壁外血管侵犯及預(yù)后的評(píng)估價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選取2018年1～12月遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院老年直腸癌患者85例。入選標(biāo)準(zhǔn)：①無(wú)手術(shù)禁忌證，接受直腸癌根治術(shù)治療；②術(shù)后病理檢查確診為直腸癌；③術(shù)前10 d內(nèi)行直腸腔內(nèi)三維超聲檢測(cè)；④術(shù)后留取病理標(biāo)本，隨訪治療和臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前有放化療等抗治療史；②存在其他部位原發(fā)性腫瘤；③精神異常，無(wú)法配合隨訪。其中男50例，女35例；年齡60～81歲，平均(71.56±5.14)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，患者自愿參與并簽署知情同意書。

1.2直腸腔內(nèi)三維超聲檢查 使用彩色多普勒超聲診斷儀進(jìn)行直腸腔內(nèi)三維超聲檢查，腔內(nèi)3D探頭頻率分別為6、9、12 MHz。檢查前2 h進(jìn)行腸道準(zhǔn)備，患者腸道清潔完成后行側(cè)臥位肛門指檢，判斷腫瘤病灶的質(zhì)地、位置、解剖學(xué)結(jié)構(gòu)等，使用一次性灌注器皿注入100 ml無(wú)菌耦合劑，超聲探頭保護(hù)套后進(jìn)入肛門至腫瘤病灶位置，觀察病變浸潤(rùn)深度、體積大小、周圍組織淋巴結(jié)個(gè)數(shù)。三維立體成像后觀察腫瘤病灶周圍是否有擴(kuò)張血管或異常走行及血流充盈情況。直腸癌壁外血管侵犯的診斷按照Smith等〔7〕提出的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，0分：非結(jié)節(jié)狀腫瘤侵至腸壁肌層；1分：結(jié)節(jié)狀腫瘤侵出腸壁；2分：腫瘤周邊有供血血管，但血管輪廓無(wú)異常，且無(wú)血管狹窄和擴(kuò)張，無(wú)異常實(shí)性信號(hào)；3分：腫瘤周圍血管中有異?；芈?，血管輪廓略微擴(kuò)張，或有輕微血管狹窄和擴(kuò)張；4分：腫瘤周圍血管中有異常回聲，血管輪廓不規(guī)則擴(kuò)張。3～4分者需要聯(lián)合血管內(nèi)血流充盈情況；0～2分診斷為壁外血管侵犯陰性，3～4分診斷為壁外血管侵犯陽(yáng)性。

1.3FHIT 和Apollon 蛋白表達(dá)檢測(cè) 收集老年直腸癌患者癌組織和距離腫瘤病灶約3 cm的癌旁組織，均使用10%中性甲醛溶液固定，剪成邊長(zhǎng)為1 cm的組織塊，梯度乙醇脫水，二甲苯固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。將切片脫蠟至水，熱修復(fù)抗原，3%過(guò)氧化氫孵育后，磷酸緩沖鹽溶液洗滌，轉(zhuǎn)入封閉液中封閉。每張切片中均加入鼠抗人FHIT 多克隆抗體(1∶500稀釋)，鼠抗人Apollon 多克隆抗體(1∶500稀釋)，37℃條件下孵育2 h，滴加生物素標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，1∶2 000稀釋，37℃條件下孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺法顯色，蘇木精復(fù)染，封片后再光學(xué)顯微鏡下觀察。高倍鏡視野下隨機(jī)選取切片的5個(gè)視野，根據(jù)染色強(qiáng)度分為：無(wú)色0分、黃色1分、棕黃色2分、褐色3分；根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例分為：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞0分、≤10%及1分、10%～50% 2分、51%～75% 3分、>75% 4分。染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞比例乘積≤1為陰性，≥2為陽(yáng)性。

1.4資料收集及隨訪觀察 收集患者性別、年齡、T分期、N分期、分化程度、癌胚抗原水平及術(shù)后病理診斷壁外血管侵犯情況。手術(shù)治療后對(duì)患者進(jìn)行3年隨訪，采用門診復(fù)查結(jié)合電話隨訪的方式進(jìn)行，記錄患者生存時(shí)間。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行Kappa分析、χ2檢驗(yàn)、受試者工作特征(ROC)曲線分析和Kaplan-Meier曲線分析。

2 結(jié) 果

2.1不同臨床病理特征老年直腸癌患者壁外血管侵犯情況比較 不同年齡、T分期、N分期、分化程度、癌胚抗原水平血管侵犯陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 不同臨床病理特征老年直腸癌患者壁外血管侵犯情況比較〔n(%)〕

2.2直腸腔內(nèi)三維超聲對(duì)老年直腸癌患者壁外血管侵犯的診斷分析 以術(shù)后病理結(jié)果為診斷血管侵犯的金標(biāo)準(zhǔn)，71例術(shù)后病理結(jié)果血管侵犯陰性患者中直腸腔內(nèi)三維超聲正確診斷68例，誤診3例；14例術(shù)后病理結(jié)果血管侵犯陽(yáng)性患者中直腸腔內(nèi)三維超聲正確診斷10例，誤診4例；直腸腔內(nèi)三維超聲診斷老年直腸癌患者壁外血管侵犯的準(zhǔn)確率為91.76%(Kappa=0.752，P=0.005)。

2.3FHIT 蛋白對(duì)老年直腸癌患者壁外血管侵犯的診斷分析 71例術(shù)后病理結(jié)果血管侵犯陰性患者中FHIT 蛋白陰性66例，誤診5例；14例術(shù)后病理結(jié)果血管侵犯陽(yáng)性患者中FHIT 蛋白陽(yáng)性8例，誤診6例；FHIT 蛋白陽(yáng)性診斷老年直腸癌患者壁外血管侵犯的準(zhǔn)確率為87.05%(Kappa=0.692，P=0.010)。

2.4Apollon 蛋白對(duì)老年直腸癌患者壁外血管侵犯的診斷分析 71例術(shù)后病理結(jié)果血管侵犯陰性患者中Apollon蛋白陰性63例，誤診8例；14例術(shù)后病理結(jié)果血管侵犯陽(yáng)性患者中Apollon 蛋白陽(yáng)性8例，誤診6例；Apollon蛋白陽(yáng)性診斷老年直腸癌患者壁外血管侵犯的準(zhǔn)確率為83.53%(Kappa=0.657，P=0.018)。

2.5不同臨床病理特征老年直腸癌患者FHIT和Apollon 蛋白陽(yáng)性表達(dá)比較 不同年齡、T分期、N分期、分化程度、癌胚抗原水平FHIT和Apollon蛋白陽(yáng)性率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。見表2。

表2 不同臨床病理特征老年直腸癌患者FHIT和Apollon 蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況比較〔n(%)〕

2.6直腸腔內(nèi)三維超聲及FHIT、Apollon 蛋白對(duì)老年直腸癌患者壁外血管侵犯的診斷效能分析 ROC曲線分析顯示，直腸腔內(nèi)三維超聲、FHIT蛋白、Apollon 蛋白單獨(dú)和聯(lián)合檢測(cè)對(duì)老年直腸癌患者壁外血管侵犯均具有較高的診斷價(jià)值(P<0.05)；其中直腸腔內(nèi)三維超聲及FHIT、Apollon 蛋白聯(lián)合檢測(cè)的診斷價(jià)值最高(AUC=0.836)，靈敏度明顯高于各指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)。見圖1、表3。

表3 直腸腔內(nèi)三維超聲及FHIT、Apollon 蛋白對(duì)老年直腸癌患者壁外血管侵犯的診斷價(jià)值分析

2.7老年直腸癌患者3年生存情況的Kaplan-Meier曲線分析 直腸腔內(nèi)三維超聲、FHIT蛋白、Apollon 蛋白陽(yáng)性的老年直腸癌患者3年生存率明顯低于直腸腔內(nèi)三維超聲、FHIT蛋白、Apollon 蛋白陰性者(Log-rankχ2=13.481、10.635、9.873，均P<0.05)。見圖2。

3 討 論

研究者顯示壁內(nèi)血管與壁外血管區(qū)別后，直腸癌壁外血管侵犯是固有肌層外的脈管細(xì)胞中有腫瘤細(xì)胞侵犯，該類患者5年生存率低于30%〔8〕。相關(guān)研究顯示，直腸癌壁外血管侵犯陰性者治療后長(zhǎng)期生存率明顯高于陽(yáng)性患者〔9〕。磁共振成像是術(shù)前評(píng)估壁外血管侵犯的主要手段，但臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，磁共振成像檢出的壁外血管侵犯患者明顯多于組織病理學(xué)〔10〕，提示仍需要探索補(bǔ)充診斷壁外血管侵犯的治療來(lái)提高診斷的準(zhǔn)確性。直腸腔內(nèi)三維超聲檢查多用于直腸癌患者T分期和N分期評(píng)估，在早期直腸癌患者病情評(píng)估中有較高準(zhǔn)確性〔11〕。但關(guān)于直腸腔內(nèi)三維超聲評(píng)估直腸癌患者術(shù)前壁外血管侵犯的研究仍較為少見。

FHIT蛋白屬于三聯(lián)組氨酸家族，在人體多個(gè)組織器官中均有表達(dá)〔12〕。相關(guān)研究顯示，胃癌、結(jié)直腸癌組織中FHIT蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織〔13〕，提示FHIT蛋白過(guò)表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Apollon蛋白是凋亡抑制蛋白家族成員，屬于該家族中分子量最大的蛋白，其結(jié)構(gòu)中的特殊序列BIR能夠與半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9、線粒體促凋亡蛋白結(jié)合后促進(jìn)其降解，抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9前體活化，降低凋亡信號(hào)啟動(dòng)效率，腫瘤細(xì)胞無(wú)限生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)明顯增加〔14〕。本研究結(jié)果提示FHIT、Apollon蛋白表達(dá)異常升高能夠促進(jìn)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，進(jìn)而提高老年直腸癌患者壁外血管侵犯的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

FHIT 能夠通過(guò)線粒體依賴凋亡蛋白酶和死亡受體途徑抑制細(xì)胞凋亡，但具體的分子機(jī)制仍未完全明確，與Apollon蛋白表達(dá)存在一定相關(guān)性〔15〕，同時(shí)FHIT、Apollon蛋白表達(dá)與腫瘤患者的臨床病理特征可能存在相關(guān)性〔16〕。本研究結(jié)果提示FHIT、Apollon蛋白表達(dá)與老年直腸癌患者的臨床病理特征密切相關(guān)，可能用于患者的預(yù)后評(píng)估。ROC曲線分析對(duì)老年直腸癌患者壁外血管侵犯的診斷效能結(jié)果顯示，直腸腔內(nèi)三維超聲及FHIT、Apollon 蛋白聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能最高。研究者采用siRNA法下調(diào)乳腺癌細(xì)胞中Apollon 基因表達(dá)，結(jié)果顯示，乳腺癌細(xì)胞對(duì)鉑類的敏感性明顯增強(qiáng)〔17〕，說(shuō)明Apollon 表達(dá)與乳腺癌的治療轉(zhuǎn)歸存在相關(guān)性。本研究證實(shí)了直腸腔內(nèi)三維超聲檢查結(jié)果及FHIT、Apollon 蛋白表達(dá)與患者預(yù)后密切相關(guān)，可作為預(yù)測(cè)老年直腸癌患者預(yù)后的可靠指標(biāo)用于臨床治療。