隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的飛速發(fā)展,轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品市場不斷拓展,越來越多的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品商品化[1]。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展在食品中的應(yīng)用也越來越廣泛,已經(jīng)走入了大眾生活。為了提升實驗室對于植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的檢測能力,本實驗室參加了中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心組織的糧食轉(zhuǎn)基因檢測能力驗證活動。
本次能力驗證主要檢測大豆內(nèi)源基因Lectin(植物凝集素)、pCaMV35S(花椰菜花葉病毒35S啟動子)、tNOS(來源于農(nóng)桿菌的胭脂堿合成酶基因終止子)、CP4-EPSPS(根癌農(nóng)桿菌CP4蛋白基因和5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因)[2-3]。本次主要采用實時熒光PCR方法進行檢測,實時熒光PCR技術(shù)是近年來定量PCR技術(shù)中興起的最新定量檢測技術(shù)[4]。
本次實驗根據(jù)《植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實時熒光PCR定性檢驗方法》(SN/T 1204—2016)[2]和中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心的《ACAS—PT1138(2021)糧食轉(zhuǎn)基因檢測能力驗證參試指導(dǎo)書》進行檢測。
樣品:大豆轉(zhuǎn)基因樣品共2瓶,瓶號為21-E577、21-F956。樣品由中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心提供。陽性對照:大豆陽性對照從實驗室之前參加能力驗證為陽性樣品保存所獲;陰性對照:非轉(zhuǎn)基因大豆;空白對照:超純水。
試劑:實驗室超純水;植物DNA提取試劑盒;引物;探針;2×Taq PCR預(yù)混試劑(不含染料);2×Taq PCR預(yù)混試劑;dNTPs溶液;Taq DNA聚合酶(含分裝Mg2+)等。
設(shè)備:實時熒光PCR儀(美國安捷倫儀器公司);研磨器、電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司);電熱恒溫水浴鍋(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司);微型離心機(德國HETTICH);旋渦振蕩器(德國IKA);二級生物安全柜A2(新加坡ESCO);紫外分光光度計(島津儀器(蘇州)有限公司);微量移液器(德國普蘭德);高壓蒸汽滅菌器(日本株式會社平山制作所);法國AES均質(zhì)器(法國AES儀器有限公司);超純水機(Thermo Fisher SCIENTIFIC公司);酸度計(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司);藥品保存箱(青島Haier)。
1.3.1 取樣和制樣
樣品為粉末狀,離心管密封包裝。根據(jù)組織方作業(yè)指導(dǎo)書要求,將樣品混勻后取樣檢測。
1.3.2 樣品DNA的提取與純化
(1)提取。根據(jù)購置的DNA試劑盒進行樣品21-E577、21-F956中DNA的提取。取干重組織20 mg,加入400 μL緩沖液1和6 μL核酸內(nèi)切酶,渦旋振蕩,室溫放置;加入130 μL緩沖液2,充分混勻,渦旋振蕩;離心,將上清移至新的離心管中;加入1.5倍體積的緩沖液3,立即充分振蕩混勻。
(2)純化。將上述提取所得溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中),離心,倒掉廢液,吸附柱放入收集管中;向吸附柱中加入600 μL漂洗液,離心,倒掉廢液,將吸附柱放入收集管中。重復(fù)操作一次;將吸附柱放回收集管中,離心,倒掉廢液。將吸附柱置于室溫放置,徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。將吸附柱轉(zhuǎn)入干凈的離心管中,懸空滴加200 μL洗脫緩沖液,室溫放置,離心,將溶液收集到離心管中。
1.3.3 DNA濃度測定和定量
樣品21-E577、21-F956DNA用紫外分光光度計測定在260 nm和280 nm處的吸收值,分別計算核酸的純度和濃度。DNA的純度比值應(yīng)在1.7~1.9,濃度不低于 20 ng·μL-1。
1.3.4 實時熒光PCR反應(yīng)體系配制
先取4個離心管分別標(biāo)記Lectin基因、pCaMV35基因、tNOS基因、CP4-EPSPS基因,由于每個基因均有陽性、陰性、空白、21-E577樣品和21-F956樣品5個體系,每個離心管按表1反應(yīng)體系的5倍量分別用移液器添加10PCR緩沖液、dNTP、上引物、下引物、探針、Taq酶和超純水,完成后用微型離心機快速旋轉(zhuǎn)一會兒靜置。取20個PCR反應(yīng)管分別標(biāo)記Lectin-陽性、Lectin-陰性、Lectin-空白、Lectin-577、Lectin-956,pCaMV35S-陽 性、pCaMV35-陰 性、pCaMV35-空 白、pCaMV35- 577、pCaMV35- 956、tNOS-陽性、tNOS-陰性、tNOS-空白、tNOS-577、tNOS-956、CP4-EPSPS-陽性、CP4-EPSPS-陰性、CP4-EPSPS-空白、CP4-EPSPS-577和CP4-EPSPS-956,分別分裝各自的基因20 μL體系,再分別添加5 μL的DNA模板,蓋上蓋子后上機。
表1 實時熒光PCR反應(yīng)體系表
1.3.5 實時熒光PCR反應(yīng)程序
實時熒光PCR反應(yīng)參數(shù)為:50 ℃/2 min,1個循環(huán);95 ℃/10 min,1個循環(huán);95 ℃/15 s和60 ℃/60 s,40個循環(huán)。
實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)結(jié)果見表2。由表2可知,陽性對照Ct值結(jié)果均小于30,陰性對照Ct值結(jié)果均小于30,PCR反應(yīng)體系正常,結(jié)果有效。
表2 實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)結(jié)果表
樣品21-E577、21-F956 Ct分析結(jié)果見表3。由表3可知,編號為21-E577樣品的內(nèi)源基因lectin Ct值為 22.67,pCaMV35S Ct值為 26.42,tNOS Ct值為26.62,CP4-EPSPS Ct值為 23.27,編號為 21-F956樣品的內(nèi)源基因lectin Ct值為22.18,pCaMV35S Ct值為26.66,tNOS Ct值為 26.92,CP4-EPSPS Ct值為 23.08。
表3 樣品分析Ct值
綜合Ct值結(jié)果,依據(jù)SN/T 1204—2016標(biāo)準(zhǔn)中結(jié)果判定及表述,測試樣品檢測Ct值小于或等于36,內(nèi)源基因檢測Ct值小于或等于30,判定該樣品含有所檢基因或品系。判定21-E577檢出lectin基因,檢出pCaMV35S基因、tNOS基因和CP4-EPSPS基因。判定21-F956檢出lectin基因,檢出pCaMV35S基因、tNOS基因和CP4-EPSPS基因。
本次能力驗證取得滿意結(jié)果,表明實驗室已具備開展植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的檢測能力。能力驗證工作要求嚴(yán)格,需要檢測人員不斷提升自己的操作水平,不斷積累檢測經(jīng)驗。收到能力驗證樣品后,按照作業(yè)指導(dǎo)書要求室溫保存。取樣時按照要求取樣,避免對環(huán)境造成污染。確保能力驗證過程中所用到的設(shè)備狀態(tài)正常,試劑中用到Taq酶,應(yīng)提前開啟制冰機,制冰后將所用的試劑放置冰盒中,保證試劑的有效性。配制體系應(yīng)避免氣溶膠污染,每個樣品的處理均在生物安全柜內(nèi)操作[5],實驗人員做好防護措施,加樣過程中注意移液器的使用,按照設(shè)定的順序加樣,繞開非目標(biāo)管口,避免氣溶膠逸散造成假陽性結(jié)果的出現(xiàn),操作過后的生物安全柜應(yīng)及時開啟紫外燈進行消毒,避免核酸片段造成污染[6-7]。
綜上,通過此次能力驗證,實驗室對大豆中轉(zhuǎn)基因成分的實時熒光定量PCR檢測方法有了更進一步的掌握和提升,對于食品轉(zhuǎn)基因成分領(lǐng)域中的其他資質(zhì)能力,本實驗室會在后續(xù)的外部質(zhì)量控制活動中積極尋求并主動參與,保證實驗室在食品轉(zhuǎn)基因成分的持續(xù)檢測能力。