食用油是人們生活中的必需品之一，但油脂極易被氧化，不宜長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存，氧化不僅使食用油褪色、變色，還會(huì)破壞食用油中的維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而降低食用油的感官品質(zhì)，使其變質(zhì)，甚至產(chǎn)生有害物質(zhì)，引起食物中毒[1]。因此在食用油生產(chǎn)過程中需要加入抗氧化劑。目前，食品抗氧化劑在食用油中的應(yīng)用極為廣泛，常用的食品抗氧化劑種類有人工合成的叔丁基對(duì)羥基茴香醚（Butyl Hydroxy Anisol，BHA）、二丁基羥基甲苯（Dibutyl Hydroxy Toluene，BHT）、沒食子酸丙酯（Propyl Gallate，PG）、叔丁基對(duì)苯二酚（Tert-Butylhydroquinone，TBHQ）[2]。本實(shí)驗(yàn)以上述4種常見的抗氧化劑為研究對(duì)象。此外，參考近年間白酒中檢測(cè)出塑料制品用塑化劑的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)把食品接觸材料（塑料瓶）中的常見抗氧化劑也一起列入研究范圍[3]。食用油在長(zhǎng)期儲(chǔ)存的情況下，盛裝容器添加的抗氧化劑有可能滲透或者遷移到食用油中，并隨著食品進(jìn)入人體，對(duì)機(jī)體內(nèi)正常的內(nèi)分泌系統(tǒng)造成影響，干擾機(jī)體內(nèi)激素的合成、釋放、運(yùn)轉(zhuǎn)、代謝及結(jié)合的過程，有損血漿中正常激素水平的維持，故將塑料中常用的2,2'-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）（抗氧化劑2246）、四（3,5-二叔丁基-4-羥基）苯丙酸季戊四醇酯（抗氧化劑1010）和三（2,4-二叔丁基苯基）亞磷酸酯（抗氧化劑168）這三種抗氧化劑作為補(bǔ)充研究對(duì)象，彌補(bǔ)食用油中抗氧化劑檢測(cè)的遺漏[4]。

目前，《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中9種抗氧化劑的測(cè)定》（GB 5009.32—2016）規(guī)定了食品中9種抗氧化劑的測(cè)定方法。《食品容器、包裝用塑料原料 第2部分：聚乙烯中抗氧劑和芥酸酰胺爽滑劑的測(cè)定 液相色譜法》（SN/T 1504.2—2017）規(guī)定了食品容器，包裝用塑料原料抗氧化劑的測(cè)定方法，而對(duì)于可能存在于食品中由塑料產(chǎn)品遷移到食品中的幾種常見抗氧化劑的測(cè)定尚未規(guī)定方法。

本文采用高效液相色譜法技術(shù)建立了一種簡(jiǎn)單、快速測(cè)定食用油中多種抗氧化劑的方法。該方法具有較好的線性關(guān)系、精密度和回收率，還具有分離效能高、選擇性高、檢測(cè)靈敏度高和分析速度快等優(yōu)點(diǎn)[5-10]?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)選擇高效液相色譜法作為本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)方法，為高效液相色譜法快速測(cè)定食用油中抗氧化劑試驗(yàn)在普通實(shí)驗(yàn)室的建立和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑及耗材

1260 Infinify II高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Centrifuge 5804R高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；ME 204電子天平（瑞士梅特勒.托利多公司）、-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本EYELA公司）、超聲波清洗機(jī)（廣州吉普公司）、Milli-Q去離子水發(fā)生器（美國Millipore公司）。

甲醇（色譜純，美國賽默飛世爾科技公司）；乙腈（色譜純，美國賽默飛世爾科技公司公司）、Bond Elut C18柱（2 g，20 mL，120 μm，美國安捷倫公司）。

沒食子酸丙酯（CAS：121-79-9，純度：99.7%，Dr.Ehrenstorfer）；叔丁基對(duì)苯二酚（CAS：1948-33-0，純度：99.2%，Dr.Ehrenstorfer）；叔丁基對(duì)羥 基 茴 香醚（CAS：25013-16-5， 純 度：99.4%，Dr.Ehrenstorfer）；二丁基羥基甲苯（CAS：128-37-0，純度：100%，北京哈曼格生物科技公司）；2,2'-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）（抗氧化劑2246）（CAS：119-47-1，純度：99.3%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；四（3,5-二叔丁基-4-羥基）苯丙酸季戊四醇酯（抗氧化劑1010）（CAS：6683-19-8，純度：98.2%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；三（2,4-二叔丁基苯基）亞磷酸酯（抗氧化劑168）（CAS：31570-04-4，純度99.05%，Dr.Ehrenstorfer）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取沒食子酸丙酯（Propyl Gallate，PG）、叔丁基對(duì)苯二酚（Tert-Butylhydroquinone，TBHQ）、二丁基羥基甲苯（Dibutyl Hydroxy Toluene，BHT）、叔丁基對(duì)羥基茴香醚（Butyl Hydroxy Anisol，BHA）、四（3,5-二叔丁基-4-羥基）苯丙酸季戊四醇酯（抗氧化劑1010）、2,2'-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）（抗氧化劑2246）、三（2,4-二叔丁基苯基）亞磷酸酯（抗氧化劑168）0.2 g（精確至0.000 1 g）于100 mL的容量瓶中，加入約5 0 mL乙腈，待完全溶解后再用乙腈定容至刻度，配制成濃度均為2 000 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液。用乙腈稀釋成濃度分別為 0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、20.0 mg·L-1、50.0 mg·L-1、100.0 mg·L-1和200.0 mg·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取1 g（精確至0.000 1 g）樣品于50 mL具塞離心管中，加入10 mL乙腈溶液渦旋提取2 min，超聲30 min，8 000 r·min-1離心1 min，收集提取液于另一離心管中，待凈化。

將提取液倒入裝有約2 g無水硫酸鈉并經(jīng)活化的C18固相萃取柱中，收集流出液，再用15 mL甲醇溶液洗脫萃取小柱，控制流速至每秒1～2滴，合并流出液與洗脫液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，于40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加2 mL乙腈復(fù)溶，充分溶解后過0.22 μm有機(jī)系濾膜，供液相色譜儀測(cè)定。

1.2.3 液相色譜條件

色譜柱：X Bridge C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相與梯度洗脫條件見表1。

表1 流動(dòng)相及梯度洗脫條件表

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 提取條件的優(yōu)化

《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中9種抗氧化劑的測(cè)定》（GB 5009.32—2016）對(duì)于油類樣品的提取采用以正己烷溶解后加入乙腈萃取的方式進(jìn)行?？紤]到本研究中作為食品包裝材料中常用的抗氧化劑2246、抗氧化劑1010和抗氧化劑168的極性小，萃取效果可能不理想，本研究直接用乙腈提取，并以加標(biāo)回收的方式與國家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如圖1所示，兩種方法的PG、TBHQ、BHA、BHT的回收率接近，而按國家標(biāo)準(zhǔn)方法提取的抗氧化劑2246、抗氧化劑1010和抗氧化劑168回收率較低。

圖1 兩種提取方法的回收率對(duì)比圖

2.1.2 凈化條件的優(yōu)化

考慮到食用油中組分相對(duì)復(fù)雜，研究人員通常用C18固相萃取柱對(duì)其進(jìn)行凈化，本研究對(duì)是否過固相萃取柱凈化做對(duì)照實(shí)驗(yàn)，取同一樣品分別以乙腈直接提取和按2.2前處理方法過柱凈化兩個(gè)方法處理后上機(jī)測(cè)定的色譜對(duì)比圖如圖2，如圖所示C18固相萃取柱的凈化效果良好。

圖2 提取后過柱與不過柱色譜圖對(duì)比圖

在確保待測(cè)物回收率不受影響的前提下盡量?jī)?yōu)化凈化效果，本文進(jìn)一步做洗脫效果的對(duì)比實(shí)驗(yàn)。對(duì)6個(gè)加標(biāo)樣品按照前處理方法提取后，將提取液加至經(jīng)活化的C18固相萃取柱，接收樣品流出液后再以每次5 mL甲醇多次淋洗C18固相萃取柱，將樣品流出液以及每次淋洗液分開收集濃縮后上機(jī)測(cè)定。6個(gè)樣品各個(gè)組分在各個(gè)流出液的平均回收率如表2所示。綜合考慮各個(gè)組分的洗脫情況，本研究采取將樣品流出液和15 mL洗脫液合并收集的方法。

表2 各組分的洗脫效果平均回收率對(duì)比表（單位：%）

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

2.2.1 線性范圍及檢出限

按照上述標(biāo)準(zhǔn)溶液配制方法配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別上機(jī)測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。7種抗氧化劑在質(zhì)量濃度范圍0.5～200.0 mg·L-1內(nèi)線性良好，再在空白樣品中加入適量的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，按照上述的前處理方法處理加標(biāo)樣品，根據(jù)色譜圖信噪比（S/N）＞3確定方法檢出限。本方法在濃度范圍0.5～200.0 mg·L-1內(nèi)的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表3。

表3 各組分線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限表

2.2.2 方法回收率和精密度

在空白樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按上述前處理方法處理后測(cè)定，當(dāng)添加水平為 5 mg·kg-1、50 mg·kg-1、100 mg·kg-1時(shí)，回收率范圍為81.66%～95.58%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）均小于10%，樣品加標(biāo)圖譜見圖3，具體平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表4。

表4 各組分平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表（n=6）

圖3 樣品加標(biāo)圖譜圖

2.2.3 實(shí)際樣品測(cè)定

按照本方法對(duì)50個(gè)市售植物油進(jìn)行檢測(cè)，其中2個(gè)樣品中檢出TBHQ，檢出含量分別為0.016 g·kg-1，0.072 g·kg-1。其他項(xiàng)目均未檢出。

3 結(jié)論

本文針對(duì)食用油中食品及食品包裝材料常見的7種抗氧化劑建立以乙腈提取、C18固相萃取柱凈化、高效液相色譜儀測(cè)定的檢測(cè)方法。本方法高效、準(zhǔn)確、靈敏度好，適用于日常食用油中抗氧化劑的檢測(cè)。