周立中

濱州市人民醫(yī)院 山東 濱州 256610

肺炎支原體(Mycoplasma pneumonia，Mp)是一種介于細(xì)菌與病毒之間﹑在有氧或無氧環(huán)境中均能獨(dú)立存活的最小病原微生物，主要通過呼吸道飛沫或氣溶膠傳播，是引起社區(qū)獲得性肺炎的重要病原體之一[1]。Mp感染早期臨床癥狀與其他細(xì)菌和病毒感染肺炎無明顯區(qū)別，多見劇烈咳嗽﹑發(fā)熱(常為稽留熱)﹑畏寒﹑頭痛和咽痛[2-3]，且對(duì)作用一般細(xì)菌細(xì)胞壁的抗生素，如青霉素﹑頭孢菌素等不敏感，必須需選用抑制蛋白質(zhì)合成的大環(huán)內(nèi)酯類﹑氟喹諾酮類﹑四環(huán)素類抗生素進(jìn)行治療。因此，Mp的早期實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)對(duì)合理選用抗生素治療具有重要意義。目前Mp實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要有分離培養(yǎng)﹑抗原檢測(cè)﹑抗體檢測(cè)和基因診斷技術(shù)檢測(cè)等。

1 分離培養(yǎng)

Mp分離培養(yǎng)作為傳統(tǒng)的檢測(cè)手段，是判斷Mp感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”。Mp分離培養(yǎng)常以牛心消化液為基礎(chǔ)另加20小牛血清及新鮮酵母浸液制成液體或固體培養(yǎng)基，初次分離需要孵育7～15d，待培養(yǎng)基指示劑由粉紅色變黃色后，及時(shí)轉(zhuǎn)種于固體平板培養(yǎng)基，5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)1～2周可長出菌落直徑小于0.5mm的荷包蛋樣菌落，以此可初步診斷，再進(jìn)一步進(jìn)行生化反應(yīng)和血清學(xué)鑒定。Kashyap等[4]認(rèn)為采用咽拭子或痰液標(biāo)本進(jìn)行Mp分離培養(yǎng)是目前檢測(cè)Mp感染的可靠方法之一，但是Mp分離培養(yǎng)對(duì)培養(yǎng)環(huán)境要求較苛刻，耗時(shí)長，一般培養(yǎng)分離陽性率不高，難以作為臨床常規(guī)項(xiàng)目開展。近年來，Puppe等[5]研發(fā)出快速檢測(cè)Mp的培養(yǎng)基，它是利用Mp生長代謝產(chǎn)物讓培養(yǎng)基液體中指示劑從紅色變成澄黃色來判斷Mp生長，快速培養(yǎng)法直接檢測(cè)Mp病原體，且培養(yǎng)基中富含高營養(yǎng)和快速生長因子，標(biāo)本中含有微量的病原體就可迅速增殖，大大縮短了培養(yǎng)時(shí)間。還有研究報(bào)道，該方法檢測(cè)Mp的假陽性率較高，但容易被細(xì)菌和真菌污染而造成假陽性，故該方法特異性還有待進(jìn)一步提高，因此有必要在培養(yǎng)48h作第一次判定結(jié)果后轉(zhuǎn)種進(jìn)一步做一般細(xì)菌培養(yǎng)。

2 抗原檢測(cè)

Mp抗原檢測(cè)方法包括對(duì)流免疫電泳(counter immunoelectro-phoresis)﹑免疫印跡(immunoblot-ting)和抗原捕獲EIA(antigen capture enzym eimmunoas-say)，這些方法操作耗時(shí)費(fèi)力，敏感性較低，并且檢測(cè)過程中需Mp特異性抗體，不適于臨床檢測(cè)。Miyashita N等[6]以不同菌株Mp單克隆抗體作為包被物，采用雙抗體夾心ELISA檢測(cè)Mp抗原，同時(shí)以PCR法作平行測(cè)定，結(jié)果顯示兩種方法無顯著性差異。該方法具有快速﹑簡(jiǎn)便﹑靈敏度高﹑特異性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，并且和其它支原體沒有交叉反應(yīng)，但同時(shí)亦需要特異性好﹑效價(jià)高的Mp單克隆抗體，所以未能廣泛普及，目前市場(chǎng)還尚無商品化的Mp抗原檢測(cè)試劑盒。

3 血清學(xué)檢測(cè)

Mp感染機(jī)體后，經(jīng)過免疫反應(yīng)體內(nèi)可產(chǎn)生特異性的IgM﹑IgG類抗體，其中IgM抗體在感染1周后可檢測(cè)出陽性，3～4周后達(dá)高峰，能作為早期感染的診斷指標(biāo)。IgG抗體出現(xiàn)較遲，其濃度峰在Mp感染后的第5周，一般提示有既往感染，單獨(dú)檢測(cè)意義不大。Mp血清學(xué)檢測(cè)主要包括非特異性抗體試驗(yàn)和特異性抗體試驗(yàn)[7]。

3.1 非特異性抗體試驗(yàn)

Mp感染機(jī)體后，血清中除出現(xiàn)特異性抗體外，還存在刺激機(jī)體產(chǎn)生的非特異性冷凝集素。該凝集素能與O型Rh陰性紅細(xì)胞在4℃條件發(fā)生凝集反應(yīng)，血清滴度≥1：64，判為陽性，效價(jià)越高或者雙份血清效價(jià)呈4倍以上，提示近期Mp感染的可能性較大[8]。非特異凝集試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，但其特異性相對(duì)較低，除Mp感染患者外，如流感病毒﹑立克次體和腺病毒等感染也會(huì)產(chǎn)生冷凝集素，造成假陽性，因此該方法只可作為輔助診斷Mp感染的方法。

3.2 特異性抗體試驗(yàn)

Mp 特異性抗體試驗(yàn)包括補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn) (Complement fixation test，CFT)﹑顆粒凝集試驗(yàn) (particle agglutination test，PAT ／ PA)﹑間接血凝試驗(yàn) (indirect hemagglutination test，IHT)﹑問接免疫熒光試驗(yàn) (Immuno-fluorescence test，IFT)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (Enzyme Linked Immunosorbent Assays，ELISA)。

3.2.1 CFT試驗(yàn)

CFT試驗(yàn)是最早應(yīng)用于Mp實(shí)驗(yàn)室常規(guī)診斷的試驗(yàn)方法。Mp的抗原糖脂成分可刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，與Mp抗體結(jié)合后形成固有補(bǔ)體使之不發(fā)生溶血反應(yīng)。該方法以Mp糖脂類抗原為標(biāo)記物，檢測(cè)血清中是否存在Mp抗體，其中抗體效價(jià)呈倍增長，或單份血清效價(jià)≥1：64～1：128者有診斷價(jià)值，通常用雙份血清試驗(yàn)可判定Mp感染是否處于急性期或恢復(fù)期。劉方鶴等[9]報(bào)道CFT試驗(yàn)反應(yīng)穩(wěn)定，敏感性和特異性均好，但較為煩瑣，且以檢測(cè)IgM抗體為主，不能檢測(cè)IgG等抗體，初次感染時(shí)出現(xiàn)陽性率高，再感染者容易出現(xiàn)假陰性，并且在老年體弱患者中，因此，即使CFT試驗(yàn)呈陰性也不可以排除Mp感染，故臨床應(yīng)用較少。

3.2.2 PA試驗(yàn)

PA試驗(yàn)是采用致敏粒子與試驗(yàn)血清進(jìn)行孵育發(fā)生凝集的血清學(xué)試驗(yàn)。雙份血清(間隔2周)抗體滴度呈4倍或4倍以上上升或降低或抗體滴度持續(xù)>1：160時(shí)，均可確診為Mp感染，這是目前國際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)。我國學(xué)者靳冰等[10]研究結(jié)果顯示PA試驗(yàn)靈敏度為96.4%，特異性為100%，以及準(zhǔn)確度為97.9%，說明PA試驗(yàn)特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便，適用于臨床快速診斷，但該方法采用的Mp進(jìn)口試劑價(jià)格昂貴，窗口期不能被檢測(cè)，易造成漏檢。

3.2.3 IHT試驗(yàn)

IHT試驗(yàn)主要用于檢測(cè)IgM抗體，在微量凝血板上被檢血清與血清對(duì)照，其余各孔加致敏紅細(xì)胞后震蕩混勻，紅細(xì)胞凝集程度在“++”﹑血凝抗體滴度≥1：32以上即有診斷意義[11]。李正秋等[12]報(bào)道，IHT實(shí)驗(yàn)的靈敏度為97.5%，顯著高于ELISA檢測(cè)法86.5%，其特異性70.9%不及ELISA檢測(cè)法91.5%，二者聯(lián)合檢測(cè)可提高檢測(cè)陽性率。該試驗(yàn)操作方法相對(duì)簡(jiǎn)單﹑快捷，但因其特異性不高，且與生殖道支原體存在交叉反應(yīng)而未推廣。

3.2.4 IFT試驗(yàn)

IFT試驗(yàn)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。該法以培養(yǎng)基中生長的Mp菌落制作抗原印片，與被檢血清(Mp—IgM﹑IgG抗體)孵育形成抗原抗體復(fù)合物，再用抗抗體的熒光標(biāo)記抗體著色，熒光顯微鏡下觀察，效價(jià)>1：16為陽性。有學(xué)者報(bào)道IFT試驗(yàn)檢測(cè)Mp感染陽性率為64%，靈敏度為98.3%，特異性為87.5%，明顯優(yōu)于快速培養(yǎng)基法(陽性率26%，靈敏度為33.3%，特異性為85%)，兩方法比較而言，該方法特異性較高，但需購置熒光顯微鏡才能觀察，只適用于一般實(shí)驗(yàn)室[13-16]。

3.2.5 ELISA試驗(yàn)

ELISA試驗(yàn)利用酶標(biāo)記抗體作為標(biāo)志物，并將提純的Mp膜蛋白P1﹑P116或P30抗原。吸附在固相載體表面，再用洗滌液將游離成分洗除，最后加入TMB底物后顯色來判斷結(jié)果。ELISA法是國內(nèi)應(yīng)用較為成熟的實(shí)驗(yàn)方法，目前臨床上多應(yīng)用商品化試劑盒來進(jìn)行快速簡(jiǎn)便檢測(cè)，Narita Mitsu等[17]研究認(rèn)為ELISA法具有較好的準(zhǔn)確度和特異性，可分別高達(dá)96%﹑98%，優(yōu)于CFT法，是診斷Mp感染實(shí)用可靠的手段，并且敏感﹑快速，適合于各級(jí)臨床實(shí)驗(yàn)室，可作為Mp感染的常規(guī)檢測(cè)方法。

4 分子生物學(xué)檢測(cè)

自1980年以來，通過實(shí)驗(yàn)室和臨床研究，證實(shí)了聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)技術(shù)檢測(cè)Mp感染的可靠性，目前PCR技術(shù)也是國內(nèi)外發(fā)展較快的檢測(cè)支原體的方法之一。PCR可分為普通PCR﹑實(shí)時(shí)熒光定量PCR，而普通PCR容易被污染而出現(xiàn)假陽性；實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有快速，特異性強(qiáng)，靈敏度高等特點(diǎn)且無交叉反應(yīng)現(xiàn)象，對(duì)Mp感染的診斷價(jià)值優(yōu)于普通PCR法。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)患者痰液﹑咽拭子﹑支氣管灌洗液中的Mp-DNA，通過高溫加熱使模板的兩條DNA鏈解鏈后，引物分別與模板DNA和熒光探針一起退火，通過基因擴(kuò)增技術(shù)，可以在短時(shí)間內(nèi)使含量極低的核酸片段擴(kuò)展至數(shù)百萬個(gè)拷貝，可檢出≥10cfu／mL的Mp。研究[18-24]發(fā)現(xiàn)，PCR診斷Mp感染的陽性率為73%，明顯高于培養(yǎng)法25%，但血清學(xué)陽性率為98.5%，PCR靈敏度不及血清學(xué)，但特異性能達(dá)到97%，在Mp感染早期診斷優(yōu)于培養(yǎng)法和血清學(xué)試驗(yàn)。PCR技術(shù)大大提高了檢測(cè)特異性，并且可了解Mp在患者體內(nèi)感染及自我復(fù)制的情況，對(duì)早期檢測(cè)Mp感染具有重要意義口。但其過于敏感，操作不當(dāng)或環(huán)境因素容易受到污染會(huì)導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)假陽性或假陰性，另外該技術(shù)要求特殊儀器設(shè)備，較高的人員素質(zhì)，所以在縣級(jí)醫(yī)院中難以普及。

5 展望

綜上所述，基于分離培養(yǎng)﹑抗原檢測(cè)﹑抗體檢測(cè)和基因診斷技術(shù)為Mp感染的診斷提供了非常有效的檢測(cè)手段，但迄今為止還尚無統(tǒng)一的Mp實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法。由于各種檢測(cè)技術(shù)參差不齊，各種檢測(cè)手段都有優(yōu)缺點(diǎn)，建議根據(jù)臨床要求，選擇合適的檢測(cè)方法，如Mp初篩可選用靈敏度較高的ELISA法﹑確診可采用特異性較好的分子生物學(xué)診斷方法，同時(shí)還可采用多種檢測(cè)手段結(jié)合可提高M(jìn)p感染陽性檢出率。相信隨著Mp基礎(chǔ)研究的深入以及檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，必將發(fā)現(xiàn)新的Mp檢測(cè)靶點(diǎn)，并開發(fā)出更加特異﹑敏感的檢測(cè)方法，從而能夠準(zhǔn)確﹑快速地診斷Mp感染。