陸艷艷 沈剛 王劍波 朱宏偉 趙軍寧? 郝俊杰 何世堂?

(1 中國科學(xué)院聲學(xué)研究所北京 100190）

(2 四川省中醫(yī)藥科學(xué)院成都 610041）

0 引言

麝香是一味沿用至今的稀貴中藥材，為鹿科馬麝、林麝或原麝雄體香囊中的干燥分泌物。麝香含有大環(huán)化合物如麝香酮、甾族化合物(雌二醇、膽甾醇)等。麝香酮是麝香的主要有效成分之一，具有開竅醒神、活血通經(jīng)、消腫止痛等功效，且具有雙向調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗炎、強(qiáng)心、抑制腫瘤細(xì)胞，對(duì)缺血性心臟障礙有預(yù)防和治療的作用[1-2]。

麝香中麝香酮常用的檢測方法有高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)、氣相色譜法(Gas chromatography,GC)、紫外-可見分光光度法(Ultraviolet and visible spectrophotometry,UV)等[3-4]，然而這些方法的檢測儀器體積過于龐大，且分析時(shí)間較長，一般需要30 min以上，只適用于實(shí)驗(yàn)室分析，無法滿足現(xiàn)場快檢(Point-of-care testing,POCT)需求。

聲表面波(Surface acoustic wave,SAW)傳感器作為一種聲-電換能器，能夠在很小的叉指換能器中實(shí)現(xiàn)。傳感器由兩個(gè)基本相同的SAW器件與對(duì)應(yīng)的振蕩電路構(gòu)成。一路振蕩器與氣相色譜結(jié)合，使用精密溫控來吸附待測氣體，作為測試回路；另一路振蕩器則作為參考基準(zhǔn)，計(jì)算差頻后可最大程度上消除外圍環(huán)境如振動(dòng)、溫度等對(duì)于振蕩器頻率穩(wěn)定性的影響。聲表面波傳感器面積僅12 mm2，因此檢測器體積相對(duì)較小[5-6]。

本實(shí)驗(yàn)使用中國科學(xué)院聲學(xué)研究所與四川省中醫(yī)藥科學(xué)院聯(lián)合研制的氣相色譜-聲表面波(GCSAW)聯(lián)用技術(shù)對(duì)麝香進(jìn)行快速檢測，其具體的原理框圖見圖1[5]。在采集階段，麝香樣品通過采樣泵進(jìn)入預(yù)濃縮管，在預(yù)濃縮管麝香樣品揮發(fā)性成分被吸收；在進(jìn)樣分析階段，切換六通閥，載氣瓶中的氮?dú)獍杨A(yù)濃縮管(溫度升高至250°C)中采集到的樣品帶入色譜柱?；衔镞M(jìn)入色譜柱，色譜柱只有1 m長，采用柱上升溫系統(tǒng)，使得色譜柱升溫速率較快，達(dá)到10°C/s。不同化合物在色譜柱分離效果會(huì)不一樣，其到達(dá)檢測器的時(shí)間也會(huì)不同，根據(jù)化合物出峰時(shí)間進(jìn)行定性分析；不同質(zhì)量的化合物會(huì)引起檢測器頻率發(fā)生改變，根據(jù)檢測器頻率的變化量可對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析。

圖1 聲表面波氣相色譜儀原理框圖[5]Fig.1 Principle block diagram of SAW gas chromatograph[5]

利用GC-SAW聯(lián)用技術(shù)對(duì)麝香易揮發(fā)性成分進(jìn)行定性、定量分析，具有分析操作簡便、體積小、分析速度快等特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)化合物的廣譜(揮發(fā)和半揮發(fā)性有機(jī)物)、高靈敏度(10-12級(jí))、快速(＜5 min)分析[5]，適合于現(xiàn)場分析。目前GC-SAW在水質(zhì)監(jiān)測、環(huán)境、精油等方面體現(xiàn)了較好的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)[7-9]，但在中藥麝香酮含量的檢測還未涉及。本文研究了GC-SAW在中藥麝香檢測中的方法學(xué)應(yīng)用，為中藥麝香中麝香酮的現(xiàn)場快速定量分析提供一種新的快捷的檢測技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)耗材與設(shè)備

聲表面波氣相色譜儀：中國科學(xué)院聲學(xué)研究所(諧振型聲表面波傳感器，基頻500 MHz；色譜柱DB-5(1 m×0.18 mm×0.25 μm))。恒溫加熱器：廈門宇電科技有限公司。

高純氮?dú)?99.999%)：北京兆格氣體科技有限公司。乙醇(≥99.5%)：TEDIA。麝香酮標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 mg/mL)，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心。S1-S16麝香樣品：由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院方清茂研究員鑒定為中藥麝香正品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 麝香酮標(biāo)準(zhǔn)品的配制

標(biāo)準(zhǔn)品配制：取質(zhì)量濃度為100 mg/mL的麝香酮標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)過逐級(jí)稀釋，分別配制含量為0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、0.8 μg/mL、1.6 μg/mL和3.2 μg/mL的麝香酮標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品的前處理

樣品前處理：取干燥的麝香樣品20 mg放入試劑瓶中，加入5 mL無水乙醇，超聲30 min后，使用0.45 μm微孔濾膜過濾，得到濾液，取20 μL于2 mL無水乙醇中，得到待測樣品。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

色譜條件：DB-5色譜柱，初始溫度45°C，按10°C/s程序升溫至180°C。進(jìn)樣口溫度為200°C；檢測器溫度為40°C；六通閥溫度為160°C；載氣為99.999%純度的氮?dú)猓? mL/min；泵吸時(shí)間為10 s；分析時(shí)間為20 s[10-11]。1.6 μg/mL麝香酮標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣0.1 μL，如圖2所示，麝香酮保留時(shí)間為6.62 s，峰形較好，在20 s時(shí)間內(nèi)可達(dá)到良好的分離效果。

圖2 1.6 μg/mL麝香酮標(biāo)準(zhǔn)溶液測試色譜圖Fig.2 Test chromatogram of 1.6 μg/mL muscone standard solution

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

取含量為0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、0.8 μg/mL、1.6 μg/mL、3.2 μg/mL和10 μg/mL的麝香酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，在2.1節(jié)的色譜條件下分別測試3次，以麝香酮的質(zhì)量濃度對(duì)其響應(yīng)值(峰面積)均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸曲線方程為y=1830.3x+364.88，相關(guān)系數(shù)R=0.9976，在0.2～10 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(圖3)。

圖3 GC-SAW中不同質(zhì)量濃度麝香酮的響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(n=3)Fig.3 Response standard curves of musk with different concentrations in GC-SAW(n=3)

依據(jù)校準(zhǔn)曲線的偏差和斜率方法計(jì)算麝香酮檢測限和定量限，根據(jù)已知標(biāo)準(zhǔn)曲線已知質(zhì)量濃度的響應(yīng)值，使用Excel中的Linest函數(shù)和檢出限公式如下：檢測限D(zhuǎn)L=3.3σ/S；定量限QL=10σ/S，其中，σ為標(biāo)準(zhǔn)偏差；S為斜率。計(jì)算得到麝香酮檢出限為0.158 μg/mL，進(jìn)樣量為0.1 μL，即檢出限絕對(duì)質(zhì)量為15.8 pg。計(jì)算麝香酮定量限為0.478 μg/mL，進(jìn)樣量為0.1 μL，即定量限絕對(duì)質(zhì)量為47.8 pg。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

對(duì)0.2 μg/mL、0.8 μg/mL、3.2 μg/mL三種質(zhì)量濃度的麝香酮標(biāo)準(zhǔn)溶液分別連續(xù)測定6次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative standard deviation,RSD)分別為3.24%、3.09%和2.89%(見表1)。測試結(jié)果表明該方法的精密度良好。

表1 不同質(zhì)量濃度麝香酮標(biāo)液精密度測試數(shù)據(jù)(n=6)Table 1 Precision test data of different concentrations of muscone standard solution(n=6)

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取配制好的質(zhì)量濃度為0.8 μg/mL和3.2 μg/mL麝香酮標(biāo)準(zhǔn)溶液各6瓶，每瓶測定3次取平均值，計(jì)算組間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值，測試結(jié)果見表2。測試麝香酮重復(fù)性RSD值為4.23%以內(nèi)，表明該方法的重復(fù)性較好。

表2 麝香酮溶液重復(fù)性測試數(shù)據(jù)(n=3)Table 2 Repeatability test data of muscone solution(n=3)

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取配制好的質(zhì)量濃度為0.8 μg/mL的麝香酮溶液，放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后分別測定其響應(yīng)，每瓶測定3次取平均值，表3結(jié)果顯示，其RSD值為4.49%以內(nèi)，表明該溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表3 麝香酮甲液穩(wěn)定性測試數(shù)據(jù)(n=3)Table 3 Stability test data of muscone solution(n=3)

2.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

1號(hào)干燥麝香樣品取6份，每份約10 mg，分別置于試劑瓶中，各加入100 mg/mL麝香酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液3.5 μL，再加入無水乙醇5 mL，超聲30 min后，使用0.45 μm微孔濾膜過濾，得到濾液，取20 μL混入2 mL無水乙醇中，得到待測樣品。進(jìn)樣0.1 μL測試，每瓶測定3次，取平均值計(jì)算回收率，結(jié)果如表4所示，平均回收率為98.64%，RSD為4.53 %。

表4 不同質(zhì)量濃度麝香酮標(biāo)液加樣回收率測試數(shù)據(jù)Table 4 Recovery rate test data of muscone standard solution with different concentrations

2.7 中藥麝香樣品測試

根據(jù)2.1節(jié)的測試條件，測試16組不同產(chǎn)地、不同年齡段和不同品種的麝香樣品，每組測試3次，1號(hào)麝香樣品測試結(jié)果如圖4所示，16組麝香樣品中麝香酮的含量如表5所示。

表5 16組樣品中麝香酮含量測試結(jié)果(n=3)Table 5 Test results of muscone content in 16 groups samples(n=3)

圖4 1號(hào)麝香樣品色譜圖Fig.4 Chromatogram of No.1 musk sample

測試16組不同產(chǎn)地、不同品種、不同年齡段的麝香樣品，其麝香酮含量在2.10%～3.84%范圍內(nèi)，含量均高于藥典要求的2%。從測試結(jié)果分析，不同產(chǎn)地、不同品種、不同年齡段的麝香酮含量差異較大。四川圭興林麝中麝香酮含量最高，且三年生林麝麝香酮含量高于一年生林麝，一年生林麝麝香酮含量為3.45%，三年生麝香酮含量為3.84%。陜西鳳縣一年生林麝的麝香酮含量最低，為2.10%。三年生的林麝和馬麝中麝香酮含量均大于一年生，說明麝香生長年份越長，麝香酮含量越高。不同產(chǎn)地、不同年齡段的馬麝和林麝麝香酮含量差異不明顯。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用GC-SAW聯(lián)用技術(shù)對(duì)麝香中主要成分麝香酮探索性地進(jìn)行檢測，采用柱上升溫系統(tǒng)，7 s內(nèi)可檢出麝香酮。使用GC-SAW聯(lián)用技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)麝香酮定性、定量檢測，且具有較好的響應(yīng)特性、精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性。本文通過液體進(jìn)樣對(duì)麝香酮進(jìn)行定量分析，定量測定在0.2～10 μg/mL范圍內(nèi)有較好的線性，麝香酮的最低檢出限為15.8 pg。測試16組麝香樣品，麝香酮含量最高的為四川圭興林麝，含量最低的為陜西鳳縣林麝，三年生的麝香酮含量均大于一年生，與中草藥報(bào)道的爵香產(chǎn)量從麝一歲到三歲半呈遞增速度相符合[12-13]。麝香酮作為麝香質(zhì)量的控制指標(biāo)之一，采用GC-SAW對(duì)麝香中主要成分麝香酮進(jìn)行定量分析，可用于指導(dǎo)中藥麝香質(zhì)量評(píng)價(jià)。

本文分析GC-SAW在檢測麝香酮定量分析的潛在應(yīng)用，為中藥麝香現(xiàn)場檢測快檢提供一種新的分析技術(shù)。在此研究的基礎(chǔ)上與中國藥典方法進(jìn)行比較，中國藥典中使用傳統(tǒng)氣相色譜法測試麝香酮含量，測試一個(gè)樣品需要30 min以上，取樣量需要為200 mg，而GC-SAW分析方法可在幾十秒內(nèi)可實(shí)現(xiàn)快速檢測，取樣量只需要20 mg，在皮克級(jí)、納克級(jí)顯示出良好的靈敏度。因此，GC-SAW新方法有望作為分析中藥麝香的替代分析技術(shù)，提供簡單、快速、高靈敏度的分析方法。