劉磊 綜述劉婷婷 審校

營(yíng)口經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)中心醫(yī)院（營(yíng)口市第六人民醫(yī)院）病理科，遼寧 營(yíng)口 115007

宮頸癌是危害全球女性健康的第二大常見(jiàn)惡性腫瘤[1]。人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)[2]。高危型HPV(high-risk HPV，hrHPV)的持續(xù)感染是誘發(fā)宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)及浸潤(rùn)性宮頸癌的重要因素[3]。隨著HPV分子檢測(cè)被納入宮頸癌篩查指南，分子檢測(cè)模式的篩選對(duì)于臨床醫(yī)生和患者均至關(guān)重要。美國(guó)食品藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)先后批準(zhǔn)5種HPV分子檢測(cè)技術(shù)，即HC2 HPV、Cervista HPV HR、Cobas 4800 HPV、Aptima HPV及Onclarity HPV。由于檢測(cè)方法的多樣性，檢測(cè)結(jié)果的一致性變得尤為重要。HC2是首個(gè)獲得FDA批準(zhǔn)的應(yīng)于臨床的HPV檢測(cè)方法，其以較高的臨床敏感性和相對(duì)較高的特異性成為常規(guī)HPV檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)[4]。本文將以HC2為參考標(biāo)準(zhǔn)，比較不同檢測(cè)方法的優(yōu)劣勢(shì)，并探討檢測(cè)結(jié)果的一致性問(wèn)題。

1 HPV的結(jié)構(gòu)和致病機(jī)制

HPV是一種無(wú)包膜、雙鏈DNA病毒，結(jié)構(gòu)細(xì)分為早期(E)、晚期(L)區(qū)域和長(zhǎng)控制區(qū)域，參與的蛋白主要包括衣殼蛋白L1、癌基因蛋白E6/E7[5]。L1具有自我組裝成病毒樣顆粒的特性，與適當(dāng)佐劑結(jié)合用于HPV疫苗的研發(fā)[6]。癌基因E6/E7與宮頸上皮基底細(xì)胞基因組整合啟動(dòng)E6/E7的轉(zhuǎn)錄合成。E6/E7蛋白產(chǎn)物抑制p53和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(pRb)的功能，進(jìn)而誘導(dǎo)高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變(CIN2/CIN3)以及宮頸癌的發(fā)生[7-8]。至今已鑒定出的hrHPV有16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，疑似高危型有53、66、70、73、82[9]。HPV不同亞型的持續(xù)感染誘發(fā)宮頸癌的能力各有差異，HPV16/18是宮頸癌發(fā)生最主要的亞型，占據(jù)約70%；HPV31/33/45/52/58占據(jù)約20%[10]。

2 hrHPV檢測(cè)技術(shù)及檢測(cè)結(jié)果與HC2的比較

2.1 HC2 HPVHC2是利用全基因組RNA探針與HPV DNA單鏈雜交，特異性抗體捕獲RNA-DNA雜合體，采用化學(xué)發(fā)光和信號(hào)放大的原理快速捕獲的檢測(cè)方法。該技術(shù)可檢測(cè)13種hrHPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)，是一種半定量方法[11]。HC2對(duì)實(shí)驗(yàn)室無(wú)特殊要求，試驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)性好，以hrHPV全基因組為靶點(diǎn)，可降低HPV整合引起的假陰性結(jié)果。然而，HC2檢測(cè)技術(shù)由于缺乏內(nèi)對(duì)照，樣本中真菌乳膏等殘留導(dǎo)致的假陰性結(jié)果將會(huì)報(bào)告為陰性而非實(shí)驗(yàn)無(wú)效[12]。hrHPV探針與低危型HPV(low-risk HPV，LrHPV)亞型存在交叉反應(yīng)，HC2檢測(cè)的假陽(yáng)性率高達(dá)18.8%[13]。

2.2 Cervista HPV HRCervista于2009年獲 得FDA批準(zhǔn)，用于30歲以上婦女宮頸細(xì)胞學(xué)的聯(lián)合篩查，以及細(xì)胞學(xué)診斷為意義不明確的非典型鱗狀上皮細(xì)胞(ASC-US)患者的分型檢測(cè)。Cervista是基于酶切信號(hào)放大作用來(lái)檢測(cè)L1、E6、E7特定核苷酸序列的方法。與HC2相比，Cervista能夠檢測(cè)14種hrHPV，增加了基因型HPV66。該方法設(shè)有內(nèi)部質(zhì)控，避免了樣本量不足造成假陰性。然而，Cervista檢測(cè)與HPV67和HPV70存在交叉反應(yīng)，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性[14]。該方法同樣存在HPV定量和分型問(wèn)題。Cervista和HC2檢測(cè)結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，900名細(xì)胞學(xué)檢查均正常的女性，Cervista和HC2檢測(cè)的特異性分別為90%和96%，兩者的一致性為93%，Kappa值為0.5。在65例組織學(xué)判讀為CIN2+的女性中，Cervista和HC2檢測(cè)的特異性分別為91%和92%，兩者的一致性為95%，Kappa值為0.7[15]。

2.3 Cobas 4800 HPVCobas 4800利用Real-Time PCR技術(shù)檢測(cè)14種hrHPV，并可以明確識(shí)別基因型HPV16、HPV18。該技術(shù)已被批準(zhǔn)用于25歲以上婦女的一線初篩。與HC2相比，Cobas 4800設(shè)有β-球蛋白內(nèi)對(duì)照，實(shí)現(xiàn)了HPV DNA的定量檢測(cè)，而且HPV16和HPV18的特異性分型可以進(jìn)一步對(duì)HPV陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行分類管理。耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的一項(xiàng)研究顯示，在1 371份標(biāo)本中，HC2和Cobas 4800檢測(cè)的陽(yáng)性率分別為11.38%、13.42%，其中94%的檢測(cè)結(jié)果一致，Kappa值為0.7。在1 371例病例中，兩種測(cè)定方法結(jié)果不一致的有82例(6%)。82例患者中27例(32.9%)為HC2陽(yáng)性/Cobas 4800陰性，55例(67.1%)為Cobas 4800陽(yáng)性/HC2陰性。大約有80%的HC2陽(yáng)性/Cobas 4800陰性病例經(jīng)Linear Array基因分型檢測(cè)為L(zhǎng)rHPV陽(yáng)性，而13.3%的Cobas 4800陽(yáng)性/HC2陰性病例檢測(cè)為L(zhǎng)rHPV陽(yáng)性。該結(jié)果表明，Cobas 4800相比HC2對(duì)LrHPV的交叉反應(yīng)性更低[16]。然而，英國(guó)的一項(xiàng)回顧性分析顯示，細(xì)胞學(xué)陰性的患者中Cobas 4800檢測(cè)的陽(yáng)性率比HC2增加一倍，但臨床中CIN的檢出率沒(méi)有相應(yīng)提高，可能是Cobas 4800設(shè)置的截?cái)嘀?Cut-off)低于HC2。當(dāng)Cut-off提高時(shí)，Cobas 4800檢測(cè)結(jié)果的特異性升高[17]。

2.4 Aptima HPVAptima是FDA批 準(zhǔn) 的 首 個(gè)HPV mRNA檢測(cè)方法，適用于30歲以上和細(xì)胞學(xué)診斷為ASC-US的21～29歲婦女。該檢測(cè)分為Aptima HPV和Aptima HPV16/18/45，Aptima HPV可以檢測(cè)14種hrHPV，Aptima HPV16/18/45可 以 分 型 檢 測(cè)HPV16、HPV18、HPV45。Aptima是基于轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增技術(shù)定性檢測(cè)HPV E6/E7 mRNA，與HPV DNA相比，特異性更高，可以有效減少HPV一過(guò)性感染對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾[18]。然而，Aptima檢測(cè)與LrHPV也存在交叉反應(yīng)，但與HC2和Cobas 4800相比交叉反應(yīng)率較低[14]。一項(xiàng)比較Aptima HPV和HC2的研究表明，兩者具有檢出CIN2+的敏感性和特異性相當(dāng)，一致性為96.5%，Kappa值為0.7。然而，在細(xì)胞學(xué)異常或HPV持續(xù)感染12個(gè)月以上的患者中，Aptima HPV和Aptima HPV16/18/45檢測(cè)陽(yáng)性的患者轉(zhuǎn)診陰道鏡的數(shù)量與HC2相比明顯減少[19]。另一項(xiàng)研究表明，423例細(xì)胞學(xué)異常的患者中，Aptima和HC2具有相似的敏感性，但HC2漏檢9例CIN2+患者，推斷Aptima可能更適用于宮頸癌初篩[20]。

2.5 Onclarity HPVOnclarity于2018年獲得FDA批準(zhǔn)，用于宮頸癌的初篩。該系統(tǒng)是基于Real-Time PCR和熒光探針技術(shù)的自動(dòng)化檢測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)HPV E6/E7 DNA區(qū)域。Onclarity以β-球蛋白作為內(nèi)對(duì)照，能檢測(cè)13種hrHPV和疑似hrHPV66，并且可以提供6種基因型（HPV16、18、31、45、51和52）的分型檢測(cè)信息以及不同基因型組別（33/58、35/39/68、56/59/66）的檢測(cè)方案。有研究顯示，除HPV16、HPV18基因型外，其余高?；蛐团cCIN2+也有顯著相關(guān)性，尤其是持續(xù)感染一年或更長(zhǎng)時(shí)間[21]。因此，Onclarity HPV分型檢測(cè)可以為隨訪患者感染的亞型提供持續(xù)監(jiān)測(cè)，亦可應(yīng)用于疫苗接種效果的評(píng)估。Onclarity對(duì)比HC2的研究顯示，兩者檢測(cè)結(jié)果的一致性為92%(150/163)，13個(gè)不一致的樣本包括4個(gè)HC2陽(yáng)性/Onclarity陰性(3個(gè)CIN3和1個(gè)原位腺癌)、9個(gè)HC2陰性/Onclarity陽(yáng)性(3個(gè)CIN1、6個(gè)CIN3和2個(gè)經(jīng)Linear Array基因分型檢測(cè)也為陰性)[22]。

3 檢測(cè)結(jié)果的一致性分析

HPV初篩結(jié)果的一致性分析中，Cervista、Cobas 4800、Aptima和Onclarity與HC2對(duì) 比 發(fā) 現(xiàn)，檢 出CIN2+患者的敏感性和特異性相當(dāng)。然而，一項(xiàng)針對(duì)30～65歲婦女的HPV初篩樣本顯示，4種不同檢測(cè)方法(HC2、Cobas 4800、CLART、Aptima)表現(xiàn)出顯著差異。在2 881例樣本中，23%的樣本至少有一種檢測(cè)方法呈陽(yáng)性，其中僅42%～58%的樣本在所有檢測(cè)中均呈陽(yáng)性，不同HPV檢測(cè)方法的分析設(shè)計(jì)差異可能是初篩結(jié)果不一致的主要原因[23]。另一項(xiàng)系統(tǒng)性分析同樣顯示HC2、Cobas 4800、Cervista、CLART、Aptima、Onclarity等不同檢測(cè)方法在初篩結(jié)果中表現(xiàn)出差異，大約有30%～50%陽(yáng)性結(jié)果不一致[24]。HPV不同檢測(cè)方法初篩結(jié)果的不一致為宮頸癌篩查，尤其是HPV陽(yáng)性、細(xì)胞學(xué)陰性的婦女帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。造成HPV初篩結(jié)果不一致的原因有很多，包括檢測(cè)技術(shù)的差異，如Real-Time PCR及探針?lè)z測(cè)的差異，引物的結(jié)合區(qū)域、檢測(cè)通量差異等；檢測(cè)目標(biāo)的不同，如HC2、Cervista、Cobas 4800、Onclarity檢測(cè)HPV DNA，而Aptima檢測(cè)HPV mRNA；采樣部位的差異，有報(bào)道顯示基于信號(hào)放大原理的HPV檢測(cè)方法對(duì)陰道采集樣本敏感性和特異性較低，而PCR方法對(duì)陰道采集標(biāo)本和宮頸采集標(biāo)本敏感性和特異性相當(dāng)[25]；檢測(cè)HPV亞型的差異等。針對(duì)初篩不一致的問(wèn)題，建議采用hr-HPV檢測(cè)聯(lián)合其他方法篩查，HPV初篩陽(yáng)性患者可進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢測(cè)作為一次分流管理，細(xì)胞學(xué)陰性患者可間隔12個(gè)月重復(fù)hr-HPV檢測(cè)聯(lián)合細(xì)胞學(xué)篩查，亦可進(jìn)行HPV16/18或p16/Ki67檢測(cè)作為二次分流管理。近幾年，甲基化標(biāo)記物可用于宮頸癌篩查，研究顯示，與HPV檢測(cè)和p16/Ki67染色標(biāo)記相比，甲基化標(biāo)記物具有更高的特異性[26]。甲基化標(biāo)志物在宮頸癌篩查中的應(yīng)用日漸成熟也為HPV分流管理提供更多選擇。

4 討論

隨著HPV與宮頸癌發(fā)生關(guān)系的明確，宮頸癌篩查手段也逐漸發(fā)生變化，逐步由HPV檢測(cè)輔助細(xì)胞學(xué)檢查到與細(xì)胞學(xué)的聯(lián)合檢查，再過(guò)度到單一HPV初篩。最初，細(xì)胞學(xué)作為宮頸癌的主要篩查手段，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率顯著下降。然而，細(xì)胞學(xué)檢測(cè)的缺陷也日益凸顯，細(xì)胞學(xué)檢測(cè)出現(xiàn)敏感度低、重復(fù)性差、假陰性率高等問(wèn)題。此外，細(xì)胞學(xué)是一種主觀檢測(cè)方法，漏診率和假陽(yáng)性率均較高，在資源落后的地區(qū)細(xì)胞學(xué)醫(yī)生很難滿足大范圍篩查的需求。P16和Ki-67雙染可以提供HPV陽(yáng)性患者的分流，以及改善細(xì)胞學(xué)檢測(cè)的靈敏度。研究發(fā)現(xiàn)，與hr-HPV DNA檢測(cè)相比，P16/Ki-67雙染具有更高的特異性，但敏感性較低[27]。HPV檢測(cè)作為初篩方法具有穩(wěn)定、自動(dòng)化、高敏感性等優(yōu)勢(shì)。大量研究表明，HPV檢測(cè)相比于其他篩查方法具有更高靈敏度和陰性預(yù)測(cè)值，并且可降低聯(lián)合檢測(cè)的復(fù)雜性和資源消耗[28]。然而，HPV初篩同樣也存在局限性，易造成陰道鏡的過(guò)度轉(zhuǎn)診，引起篩查者的恐慌。HPV非依賴性宮頸腺癌的篩查也為HPV初篩帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。此外，hr-HPV檢測(cè)的有效性是否因年齡、性生活史等存在差異仍需要深入探討。

一項(xiàng)按年齡分層比較hr-HPV初篩和細(xì)胞學(xué)篩查的研究表明，hr-HPV初篩結(jié)果顯示25～35歲女性CIN3+檢出率高于35歲以上女性；在25～65歲女性中，hr-HPV初篩的CIN3+檢出率高于細(xì)胞學(xué)篩查[29]。另一項(xiàng)年齡分層資料顯示25～29歲的女性檢出CIN3+的5年風(fēng)險(xiǎn)最高，50～64歲的女性最低[30]。雖然30歲以下女性hr-HPV陽(yáng)性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)較高，但在不同年齡組之間，不同篩查方法CIN3+檢測(cè)的一致性較好[29]。此外，由于20～25歲的年輕女性hr-HPV感染的持續(xù)性和進(jìn)展率較低，幾乎在短時(shí)間內(nèi)自然消退，很少發(fā)展成CIN2陽(yáng)性。2020年，美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)(ACS)篩查指南建議宮頸癌開(kāi)始篩查的年齡為25歲，且HPV的一線篩查必須是FDA批準(zhǔn)的可以用于一線篩查的HPV檢測(cè)方法Cobas 4800和Onclarity。由于FDA批準(zhǔn)的一線HPV檢測(cè)方法尚未廣泛在臨床應(yīng)用，故將聯(lián)合篩查和單獨(dú)細(xì)胞學(xué)檢查作為可接受的篩查方案?；谝陨腺Y料，建議HPV一線初篩可以選用Cobas 4800和Onclarity；聯(lián)合細(xì)胞學(xué)篩查，5種檢測(cè)方法均可。此外，一項(xiàng)研究報(bào)告顯示，在沈陽(yáng)盛京醫(yī)院就診的15～30歲年齡組主要與HPV45感染有關(guān)，31～45歲年齡組與HPV33和HPV56感染有關(guān)，46～60年齡組與HPV16感染有關(guān)，HPV18在宮頸癌患者中感染率最高[31]。建議可以根據(jù)各地區(qū)流行的HPV感染型別、不同型別的多重感染等因素篩選合適的HPV檢測(cè)方法，Cevista、Cobas 4800、Aptima、Onclarity均具有分型優(yōu)勢(shì)。宮頸病變患者HPV感染的流行病學(xué)調(diào)查及危險(xiǎn)因素分析表明，初次性交年齡≤20歲、吸煙、流產(chǎn)次數(shù)＞1次是發(fā)生hr-HPV感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[32]。針對(duì)以上HPV感染率高的女性，建議HPV檢測(cè)聯(lián)合其他方法分流管理。

5 展望

宮頸癌是目前唯一病因明確，且可防治、可篩查、可治療的惡性腫瘤。隨著宮頸癌篩查技術(shù)的不斷提高，宮頸癌防治工作也取得相應(yīng)進(jìn)展。現(xiàn)有的宮頸癌篩查主要包括醋酸/碘染色肉眼觀察法、細(xì)胞學(xué)檢查、HPV檢測(cè)、p16/Ki67雙染色法等。醋酸/碘染色在欠發(fā)達(dá)地區(qū)是較為合適的篩查方法。細(xì)胞學(xué)檢查和HPV檢測(cè)均為宮頸癌篩查的有效手段。然而，病理醫(yī)師的匱乏與技術(shù)水平不一導(dǎo)致細(xì)胞學(xué)檢查的漏診率和誤診率均較高。近幾年，人工智能成為輔助細(xì)胞學(xué)檢查的新趨勢(shì)，提高了細(xì)胞學(xué)閱片的準(zhǔn)確性與高效性，其在宮頸癌篩查中的作用還需臨床資料進(jìn)一步確證。2018年，批準(zhǔn)FDA認(rèn)證的hr-HPV檢測(cè)應(yīng)用于一線初篩，提高了篩查的敏感性。然而，與細(xì)胞學(xué)相比，hr-HPV檢測(cè)導(dǎo)致患者轉(zhuǎn)診陰道鏡的比例較高，檢查結(jié)果的異常更容易造成患者的心理壓力。如何平衡HPV檢測(cè)的敏感性和CIN2+患者檢出的特異性仍具挑戰(zhàn)。p16/Ki67雙染色法可分流hr-HPV陽(yáng)性患者以及細(xì)胞學(xué)結(jié)果為ASC-US和低度鱗狀上皮病變(LSIL)患者，該方法可減少陰道鏡轉(zhuǎn)診率，是宮頸癌聯(lián)合篩查的潛在工具。隨著NGS技術(shù)應(yīng)用于HPV檢測(cè)，以及DNA甲基化在宮頸癌篩查中的研究，這些技術(shù)將進(jìn)一步完善HPV檢測(cè)，更有效地應(yīng)用于宮頸癌的防治。