王 偉 宮秀群

阿爾茨海默?。╝lzheimer's disease,AD）是一種隱匿起病、進行性發(fā)展的神經(jīng)退行性疾病。AD的主要臨床特征為認知障礙、精神行為異常和社會生活功能減退。據(jù)WHO統(tǒng)計，目前全球約有5 000萬人患有癡呆，其中AD是最常見的類型?！吨袊柎暮Ｄ蟾?022》[1]指出，我國60歲以上癡呆患者有1 507萬，其中AD患者有983萬。AD患者的生活能力下降，需要長期的護理和醫(yī)療服務(wù)，給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟和護理負擔(dān)。一項全國性研究顯示，2015年中國AD患者的年治療費用為1 677.4億美元，且持續(xù)上升，預(yù)計到2050中國AD患者的年治療費用將達1.8萬億美元。

AD的發(fā)病機制復(fù)雜，涉及多個病理生理過程，如β淀粉樣蛋白沉積、tau蛋白磷酸化、神經(jīng)炎癥、神經(jīng)元損傷和凋亡、突觸可塑性受損、乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)不足等[2]?，F(xiàn)有的治療藥物如膽堿酯酶抑制劑、谷氨酸受體拮抗劑等只能改善和緩解臨床癥狀，但不能逆轉(zhuǎn)病情的發(fā)展且存在副作用[2]。長期的臨床實踐表明，中藥復(fù)方因副作用小，且具有多成分多作用靶點的特點，成為近年來AD藥物研究的熱點[3]。

通竅活血湯（Tongqiao Huoxue decoction,TQHXD）是清代名醫(yī)王清任創(chuàng)立的中醫(yī)經(jīng)典方劑，由桃仁、紅花、川芎、赤芍、大棗、蔥、生姜和麝香8味中藥構(gòu)成，具有通竅醒神、活血化瘀之功效。多項臨床研究表明，TQHXD能夠改善癡呆患者的認知功能，提高日常生活能力[4-5]。但TQHXD治療AD的機制仍不明確，本文以TQHXD中活性成分為研究對象，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合GEO芯片及分子對接方法，挖掘TQHXD的主要活性成分和靶點，建立中藥活性成分-靶點-疾病之間的關(guān)系，探究TQHXD治療AD的分子基礎(chǔ)和作用機制，為TQHXD的進一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 TQHXD藥物成分及靶點獲取

通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫分析平臺（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）獲得TQHXD中桃仁、紅花、川芎、赤芍、大棗、蔥、生姜7味中藥的所有化合物成分，TCMSP數(shù)據(jù)庫未收錄麝香，故通過檢索TCMID（http://47.100.169.139/ tcmid）數(shù)據(jù)庫獲得麝香的藥物成分。根據(jù)吸收、分布、代謝、排泄（absorption,distribution,metabolism,and excretion,ADME）規(guī)則，以口服生物利用度（oral bioavailability,OB）≥30%，藥物類藥性（drug-likeness,DL）≥0.18為篩選條件，篩選TQHXD有效成分[6]。中藥的活性成分通過調(diào)節(jié)靶點來發(fā)揮相關(guān)的生物功能?；谂潴w預(yù)測法，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得TQHXD各個有效成分的作用靶點。

1.2 AD差異基因獲取

GEO數(shù)據(jù)庫是美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）的一個子數(shù)據(jù)庫[7]，收集了世界各國研究機構(gòu)提交的人、大鼠、小鼠等基因表達、測序及甲基化數(shù)據(jù)。通過對芯片進行差異分析，可以篩選出在疾病等特定環(huán)境下差異表達的基因網(wǎng)絡(luò)。通過 GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫，以Alzheimer’s disease為檢索詞，物種限定為Homo sapiens獲取GSE33000數(shù)據(jù)集文件，包括非癡呆對照組157例，AD組310例，樣本均來自貢獻者死后的前額葉皮層（BA9）。應(yīng)用R語言limma包對表達矩陣進行差異分析，以|log2FC|＞0.2，P＜0.05為條件，篩選出AD組和非癡呆對照組的差異基因，采用R語言ggplot2包繪制差異基因火山圖。

1.3 TQHXD藥物成分-靶點-差異基因-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將TQHXD各藥物成分作用靶點與AD芯片數(shù)據(jù)差異基因進行取交集，得到TQHXD治療AD的關(guān)鍵作用靶點（藥物-疾病靶點）。運用Cytoscape 3.7.2軟件繪制藥物活性成分-靶點-疾?。ˋD）之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 TQHXD治療AD的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和核心靶點篩選

將TQHXD作用靶點與AD差異基因取交集后上傳至String數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org），物種選擇人類（homo sapiens），靶點直接的最低聯(lián)系分數(shù)＞0.4，設(shè)置隱藏不與其他靶點相聯(lián)系的靶點，得到蛋白質(zhì)間相互作用信息，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。將String數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析，篩選核心靶點。篩選標準包括Betweenness（BC）、Closeness（CC）、Degree（DC）、Eigenvector（EC）、Local Average Connectivity-based method（LAC）、Network（NC），只有靶點分值均大于節(jié)點中位數(shù)時將其定義為核心靶點。

1.5 TQHXD治療AD分子靶點基因本體（GO）富集分析

通過R 4.1.2軟件，應(yīng)用clusterprofiler包對TQHXD治療AD的潛在靶點進行GO富集分析，以P＜0.05為篩選條件獲取生物進程（biological process,BP）、細胞組分（cellular component,CC）、分子功能（molecular function,MF）富集分析數(shù)據(jù)。根據(jù)基因富集數(shù)目和顯著程度（pvalue Cutoff＜0.05），選取排名前20的結(jié)果，繪制TQHXD治療AD分子靶點的GO富集分析氣泡圖。

1.6 TQHXD治療AD分子靶點基因京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析和基因-KEGG網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過R 4.1.2 軟件，應(yīng)用clusterprofiler包對TQHXD治療AD潛在靶點進行KEGG通路富集分析，根據(jù)基因富集數(shù)目和顯著程度（pvalue Cutoff＜0.05），選取排名前20的結(jié)果繪制TQHXD治療AD分子靶點的KEGG通路富集分析氣泡圖。KEGG通路富集分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，根據(jù)Degree值繪制KEGG通路-基因網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 分子對接

將1.4中篩選出的核心靶點通過RCSB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（PDB）（https://www.rcsb.org/）下載蛋白受體的PDB格式文件。使用Pymol軟件對蛋白受體進行去水、加氫、刪除配體、調(diào)整電荷等處理。通過PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下載與核心靶點對應(yīng)的中藥有效成分（小分子配體）的2D結(jié)構(gòu)文件，應(yīng)用Chemoffice軟件將2D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為3D結(jié)構(gòu)。將蛋白受體和小分子配體導(dǎo)入Auto Dock Vina 軟件進行分子對接，利用 PyMol 軟件繪制對接結(jié)果圖。

2 結(jié)果

2.1 TQHXD活性成分與靶點

共獲得TQHXD各藥物的活性成分共125個，其中赤芍29個，川芎7個，蔥6個，大棗29個，紅花22個，生姜5個，麝香4個，桃仁23個。見表1。去除重復(fù)值得到TXHXD有效成分107個。各藥物成分相應(yīng)的靶點分別為赤芍158個，川芎42個，蔥88個，大棗435個，紅花449個，生姜75個，麝香24個，桃仁139個（補充材料1）。對靶點進行基因注釋，刪除重復(fù)值，得到TQHXD靶點236個。

表1 TQHXD各藥物的活性成分

2.2 AD差異基因分析結(jié)果

GEO數(shù)據(jù)庫下載AD數(shù)據(jù)集GSE33000和對應(yīng)的注釋文件GPL4372，利用R軟件及相關(guān)軟件包對數(shù)據(jù)進行過濾及標準化、注釋，篩選差異基因。得到對照組與AD組1 262個差異基因，其中678個上調(diào)，584個下調(diào)。見圖1。

圖1 GSE33000基因芯片中對照組和AD組的基因差異表達火山圖

2.3 TQHXD治療AD的活性成分與靶點網(wǎng)絡(luò)

通過Cytoscape軟件對TQHXD的8 味中藥及其107個活性成分，236個靶點基因進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化。見圖2。網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中共有 59 個節(jié)點，31個活性成分作用靶點，共有89條邊代表靶點和有效成分之間的相互作用。

圖2 TQHXD治療AD的藥物成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.4 TQHXD治療AD的PPI網(wǎng)絡(luò)與核心靶點篩選

將TQHXD治療AD潛在靶點與AD差異基因取交集后，得到31個交集基因（圖3），將交集基因列表導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。見圖4。在所得網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上使用Cytoscape軟件中CytoNCA插件構(gòu)建拓撲網(wǎng)絡(luò)，通過前文方法中所述篩選標準，共篩選到3個靶點NFKBIA、IL6、CCL2位于網(wǎng)絡(luò)的核心位置。見圖5。

圖3 TQHXD潛在靶基因與AD差異基因的韋恩圖

圖4 TQHXD治療 AD分子靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖5 PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因篩選

2.5 TQHXD治療AD基因GO富集分析

GO富集分析結(jié)果顯示在分子功能方面，靶點涉及神經(jīng)遞質(zhì)受體活性（neurotransmitter receptor activity）、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性（postsynaptic neurotransmitter receptor activity）、兒茶酚胺結(jié)合（catecholamine binding）、NAD-視黃醇脫氫酶活性（NAD-retinol dehydrogenase activity）、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（DNA-binding transcription factor binding）功能等。在生物過程方面這些靶點涉及細胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)（cellular response to oxidative stress）、對活性氧的反應(yīng)（response to reactive oxygen species）、氧化應(yīng)激反應(yīng)（response to oxidative stress）、細胞對化學(xué)應(yīng)激反應(yīng)（cellular response to chemical stress）等，分別選取前20條GO條目繪制氣泡圖。見圖6。

圖6 GO富集分析

續(xù)表1

續(xù)表1

2.6 TQHXD治療AD基因KEGG富集分析及基因-通路網(wǎng)絡(luò)

共富集到85條通路關(guān)系，這些通路涉及TNF-α、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、Legionellosis、Pertussis、流體剪切應(yīng)力信號通路（圖7）。將KEGG通路導(dǎo)入Cytoscape 軟件，取前20條通路，根據(jù)Degree值大小，顯示通路與基因的富集程度，繪制通路基因網(wǎng)絡(luò)圖（圖8）。KEGG通路基因網(wǎng)絡(luò)圖中基因節(jié)點的面積越大表示該基因參與的通路越多。根據(jù)Degree值，在網(wǎng)絡(luò)中排名前5位的基因為：RELA、MAPK8、

圖7 KEGG富集分析

圖8 TQHXD治療AD的KEGG通路與基因網(wǎng)絡(luò)

NFKBIA、IL6、CLCX2。

2.7 分子對接

由交集靶點的PPI核心網(wǎng)絡(luò)可知，NFKB1A、IL6、CCL2為TQHXD治療AD的重要靶點，通過與活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)取交集，得到MOL000098（quercetin）、MOL000006（luteolin）、MOL001002（ellagic acid）、MOL001924（paeoniflorin）是TQHXD治療AD的關(guān)鍵成分。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫下載4個活性成分的2D結(jié)構(gòu)，應(yīng)用Chem Office軟件將2D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為3D結(jié)構(gòu)。通過PDB數(shù)據(jù)庫分別下載NFKBIA、IL6、CCL2的晶體結(jié)構(gòu)1IKN（NFKBIA）、1ALU（IL6）、1DOK（CCL2），借助Auto Dock Vina軟件進行分子對接。結(jié)果表明，網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵化合物均與相應(yīng)的蛋白具有較強的親和力。見表2。借助PyMol軟件將對接結(jié)果進行可視化。見圖9。

圖9 分子對接

表2 分子對接能量

3 討論

AD是一種復(fù)雜的進行性神經(jīng)退行性疾病，由于涉及多個病理生理過程，目前仍缺乏有效的治療方法。在中醫(yī)理論體系中，AD屬于“呆病”“健忘”等范疇，是由髓海空虛、腦神失養(yǎng)、神機失用而引發(fā)的神志功能異常性疾病。治法主要為補腎益精，益氣健脾，化痰祛瘀等[8]。TQHXD為清代名醫(yī)王清任所創(chuàng)，具有通竅醒神，活血化瘀之功效，多項臨 床研究表明TQHXD能改善患者認知功能。

本研究通過設(shè)置ADME規(guī)則獲得TQHXD的107個有效成分，進一步與GEO芯片AD差異表達基因的聯(lián)合分析，得到TQHXD治療AD的31個作用靶點。通過將31個靶點構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)及網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析篩選得到TQHXD治療AD的3個核心基因

NFKBIA、IL6、CCL2。

NFKBIA基因編碼IKBα，靜息狀態(tài)下的IkBα與p65結(jié)合，遮蔽p50蛋白的核定位信號，此時NF-kB在細胞質(zhì)內(nèi)處于失活狀態(tài)。當(dāng)細胞受到LPS、ROS、TNF-α等刺激時，IKBα在蛋白酶體作用下降解，隨即與p50/p65異源二聚體解離，獲得自由的p50/p65異源二聚體迅速進入細胞核中，啟動靶基因，參與及調(diào)節(jié)各種生理及病理過程。經(jīng)尸檢發(fā)現(xiàn)，AD患者腦組織中NF-kB活性升高，并且在退變神經(jīng)元和老年斑鄰近的神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞內(nèi)檢測出p65蛋白的免疫活性。LPS可激活小膠質(zhì)細胞，經(jīng)過一系列級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞中的NF-kB p65亞基的核移位，從而促進炎癥因子（IL-1β、IL-6、Cox-2和TNF-α）的產(chǎn)生[9]。被激活的NF-kB從細胞質(zhì)遷移到細胞核，通過結(jié)合特定的DNA啟動序列調(diào)控如反應(yīng)性炎癥相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，從而加重AD患者的神經(jīng)病理損傷[10]。趨化因子CCL2又被稱為單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1），是趨化因子家族最重要的成員之一。研究發(fā)現(xiàn)患者血清及腦脊液中的CCL2增高與神經(jīng)退行性疾病進展相關(guān)。CCL2可招募、促進小膠質(zhì)細胞分化增殖，并可影響小膠質(zhì)細胞釋放炎癥因子，加速小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的β-淀粉樣蛋白異常聚集物形成，加速認知障礙的進展[11]。研究證實抑制CCL2的表達可減少小膠質(zhì)細胞的激活，減輕β-淀粉樣蛋白的沉積，改善小鼠認知功能[11]。IL6是一種多功能細胞因子，在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、炎癥及機體防御機制中起著重要作用。一項Meta分析顯示，AD患者外周血IL-6水平較對照組顯著升高，且與簡易智力狀態(tài)檢查量表（MMSE）評分正相關(guān)[12]。IL6基因敲除（knock out,KO）小鼠在被動回避和八臂迷宮測試中較野生型（wild type,WT）小鼠表現(xiàn)出更少的工作記憶錯誤[13]。IL6的存在可增強N-甲基-D-天門冬氨酸（N-methyl-D-aspartate,NMDA）和β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷[14]。IL6還可通過cdk5/p35、JAK-STAT等途徑增加tau過度磷酸化[14]。在β-淀粉樣蛋白沉積的情況下，小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞釋放IL-6，進一步加速AD的病理級聯(lián)[15]。

AD的發(fā)生發(fā)展是多個分子、多條信號通路對多種細胞生物學(xué)行為進行調(diào)節(jié)的結(jié)果。本研究通過基因富集分析獲得111個GO條目和85個KEGG通路。GO富集分析顯示TQHXD治療AD機制涉及對活性氧的反應(yīng)、細胞對化學(xué)應(yīng)激反應(yīng)、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、兒茶酚胺結(jié)合、NAD-視黃醇脫氫酶活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等生物過程。TQHXD治療AD涉及TNF-α信號通路、脂質(zhì)和動脈硬化等信號通路。TNF-α可以激活星形膠質(zhì)細胞為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞，驅(qū)動神經(jīng)炎癥過程，神經(jīng)炎癥進一步導(dǎo)致淀粉樣蛋白β沉積的增加。TNF-α與白細胞介素-1、干擾素-γ等可通過MAPK途徑誘導(dǎo)γ-分泌酶裂解淀粉樣前體蛋白[16]。TNF-α還可刺激NF-kB信號通路，從而增加淀粉樣蛋白的生成[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，除了炎癥通路，TQHXD治療AD還涉及脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路。大腦中富含大 量的脂質(zhì)，AD與脂質(zhì)的穩(wěn)態(tài)破壞有關(guān)，早、中期AD患者腦組織存在脂質(zhì)過氧化，膠質(zhì)細胞中脂質(zhì)顆粒增多[18]。AD患者血脂中HDL-C、LDL-C、TC及TG均出現(xiàn)代謝異常[19]。服用他汀類藥物可顯著降低AD的發(fā)病率，亦從側(cè)面證實脂代謝異常與AD的相關(guān)性[20]。本研究通過GO、KEGG富集分析再次證明了TQHXT治療AD的多通路、多靶點作用。

分子對接通過評估網(wǎng)絡(luò)中小分子與蛋白配體的結(jié)合能來評估分子間的相互作用，從而提高網(wǎng)絡(luò)的準確性[21]。為驗證篩選的核心靶點可靠性，對3個核心靶點與之對應(yīng)的活性成分進行分子對接，計算結(jié)合能評價結(jié)合活性。本研究分子對接結(jié)果顯示，TQHXD的4個核心成分與3個核心靶點均能有效對接。其中quercetin與3個核心靶點均有良好的結(jié)合能力。quercetin屬于類黃酮中的黃酮醇類，多項體外、在體研究發(fā)現(xiàn)其有顯著的抗炎功效[22]。quercetin可下調(diào)LPS誘導(dǎo)的細胞中TNF-α、IL-6和IL-1β的表達[23]，干擾β-淀粉樣蛋白寡聚體的形成，還可破壞β-淀粉樣蛋白纖維的穩(wěn)定性，逆轉(zhuǎn)β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性[24]。quercetin通過抑制BCAE-1的第3位碳原子上的氫鍵形成從而抑制BCAE-1的活性，減少β-淀粉樣蛋白的生成[25]。此外quercetin還可通過抑制NF-kB間接調(diào)節(jié)APP的β裂解減少β-淀粉樣蛋白的生成[26]。長期口服quercetin可顯著減少 3xTg-AD模型小鼠海馬和杏仁核的β-淀粉樣蛋白和減輕tau蛋白磷酸化趨勢，改善小鼠在高架十字迷宮中的表現(xiàn)[27]。分子對接結(jié)果進一步驗證了篩選的TQHXD治療AD核心網(wǎng)絡(luò)的準確性。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分別從藥物疾病靶點預(yù)測，差異基因篩選，PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，GO、KEGG富集分析等方面探究TQHXD治療AD的分子機制，最后通過分子對接，驗證了TQHXD有效成分與其作用靶點的良好結(jié)合活性。中藥治療AD從整體觀念出發(fā)，具有多靶點、多通路的優(yōu)勢，為TQHXD用于AD臨床治療提供了理論基礎(chǔ)。

綜上所述，TQHXD可能通過參與炎癥信號通路及相關(guān)生物功能作用于NFKBIA、IL6、CCL2等疾病靶點，發(fā)揮治療AD作用。