劉元杰，王團(tuán)結(jié)，王秀麗，張一幟，李 建，張 媛

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

疫苗的安全檢驗是指通過特定劑量接種實驗動物，根據(jù)實驗動物的反應(yīng)來確定疫苗是否安全的方法。目前我國動物疫苗的安全檢驗采用的是接種實驗動物法。在常規(guī)的注冊檢驗、復(fù)核檢驗和監(jiān)督檢驗中，安全檢驗只需要按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中安全檢驗項目進(jìn)行。而在產(chǎn)品研發(fā)過程中，針對特定產(chǎn)品，還需要進(jìn)行特殊項目的安全性評價。如對部分活疫苗，需要評價其水平傳播對其他易感動物和環(huán)境的影響；對于以基因工程技術(shù)研制的動物疫苗產(chǎn)品，要按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部有關(guān)規(guī)定，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因生物安全評價等。本文重點闡述常規(guī)安全檢驗中涉及的技術(shù)方法。

1 安全檢驗概述

1.1 免疫劑量 在細(xì)菌類動物疫苗產(chǎn)品安全檢驗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對免疫劑量的敘述中，滅活疫苗主要以體積為計量單位，如免疫2 mL、3 mL等?；钜呙缍酁閮龈擅?，主要以頭份/羽份數(shù)為計量單位，同時規(guī)定稀釋液體積。2020版《中國獸藥典》中，對個別產(chǎn)品進(jìn)行了規(guī)范，如沙門氏菌馬流產(chǎn)活疫苗(C355株)，從以菌落形成單位為計量單位變更為體積同時標(biāo)注頭份數(shù)的方式。雖然計量單位不同，但安全檢驗的接種劑量都與使用劑量遵循一定的比例原則。在使用本動物進(jìn)行安全檢驗時，接種劑量一般活疫苗不少于10個使用劑量，滅活疫苗不少于2個使用劑量[1]。疫苗研發(fā)安全試驗有一次單劑量接種、單劑量重復(fù)接種和一次超劑量接種三個過程[2]，而在安全檢驗中以一次超劑量接種為主。對于需要多次接種的產(chǎn)品，安全檢驗需要進(jìn)行多次超劑量接種，如豬支原體肺炎滅活疫苗(CJ株)[3]。

1.2免疫方法 在細(xì)菌類動物疫苗的安全檢驗中，免疫方法以皮下注射和肌肉注射為主。部分產(chǎn)品的要求更加細(xì)化，如對小鼠規(guī)定背部皮下、腿部皮下或腿部肌肉，對雞規(guī)定頸背部皮下或腿部肌肉等。除皮下注射和肌肉注射以外，在特定產(chǎn)品中還有其他的免疫方法。如沙門氏菌馬流產(chǎn)活疫苗用腹腔注射的方法接種小鼠，雞毒支原體活疫苗用點眼的方法接種SPF雞，雞毒支原體活疫苗(MG 6/85株)用噴霧方法接種SPF雞[4]，豬多殺性巴氏桿菌病活疫苗(C20株)用口服疫苗稀釋液的方法接種豬。安全檢驗的接種方法與疫苗使用方法一致，在安全檢驗實驗中，應(yīng)嚴(yán)格按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的接種方法操作。

1.3 實驗動物的替代 1959年，英國動物學(xué)家William和Rex提出在動物實驗中的減少(reduction)、替代(replacement)、優(yōu)化(Refinement)三個原則(簡稱3R原則)，后來逐漸成為現(xiàn)今動物替代方法的核心內(nèi)容[5]。使用替代動物可以從根本上減少動物實驗成本，同時也是保障動物福利的重要內(nèi)容。但隨著疫苗產(chǎn)品安全標(biāo)準(zhǔn)不斷提高，不使用替代動物成為一種趨勢。美國聯(lián)邦法規(guī)第九卷(9CFR)中對于動物疫苗安全檢驗要求必須使用本動物進(jìn)行，部分對小鼠有天然毒性的疫苗還需要以小鼠進(jìn)行安全檢驗[6]。我國農(nóng)業(yè)部2006年發(fā)布的《獸用生物制品實驗室安全試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》也在這方面進(jìn)行了補(bǔ)充，要求禽類制品安全檢驗使用本動物，其他制品除了使用靶動物以外，還須用敏感小動物進(jìn)行試驗，從本動物和小動物兩個不同的角度把控疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量安全。

1.4 實驗動物的篩選 在實驗動物應(yīng)用中，禽類要求為SPF級，小鼠、大鼠為清潔級，兔、豚鼠要求為普通級。SPF豬飼養(yǎng)成本較高，且目前在國內(nèi)尚未形成完整的質(zhì)量控制體系，在實際中很少應(yīng)用。大動物在實際應(yīng)用中通常使用普通級，所以需要對動物進(jìn)行篩選。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中帶有“健康易感”的則認(rèn)為需要進(jìn)行篩選，部分產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中沒有附加具體的動物篩選方法，需要根據(jù)抗原或抗體特性選取合適的方法進(jìn)行篩選。篩選實驗動物一般以抗原或抗體陰性為原則，具體有以下幾種方法：

1.4.1 背景追溯 背景追溯是篩選實驗動物的基本方法。具體要求為未使用過同種類型的疫苗產(chǎn)品，無相關(guān)病史。背景追溯是對實驗動物進(jìn)行初篩的最簡單、有效的方法，但只能從動物的飼養(yǎng)歷史上進(jìn)行初步判斷。無清潔級別實驗動物篩選都要進(jìn)行背景追溯，但多數(shù)產(chǎn)品還需要輔以其他篩選方法。

1.4.2 凝集反應(yīng) 凝集反應(yīng)分為平板凝集、試管凝集和微量凝集。三種凝集方法的原理本質(zhì)上都是抗原抗體產(chǎn)生的凝集反應(yīng)。平板凝集只需要2～4 min即可根據(jù)凝集情況判定結(jié)果，代表產(chǎn)品有副豬嗜血桿菌病二價滅活疫苗(1型LC株+5型LZ株)等[7]。試管凝集與微量凝集方法的區(qū)別在于反應(yīng)體系的大小，均需要反應(yīng)6 h以上，但是靈敏性要高于平板凝集方法。試管凝集在近幾年的產(chǎn)品中已經(jīng)很少應(yīng)用，以微量凝集為主。微量凝集可以對實驗動物進(jìn)行批量篩選，提高工作效率。如仔豬大腸桿菌病基因工程滅活疫苗(GE-3株)就是使用微量凝集的方法進(jìn)行實驗動物篩選[8]。

1.4.3 間接血凝(IHA) 間接血凝是將可溶性抗原或抗體吸附在具有載體和指示功能的紅細(xì)胞上，借助抗原抗體反應(yīng)將紅細(xì)胞凝集進(jìn)行觀察的方法。同凝集方法相比，間接血凝的靈敏度更高，如豬支原體肺炎滅活疫苗(NJ株)就是采用的間接血凝的方法來篩選實驗動物[9]。

1.4.4 ELISA ELISA是目前應(yīng)用最為廣泛的實驗動物篩選方法，以檢測抗體為主。ELISA方法的敏感性高于凝集反應(yīng)和IHA。通過借助酶標(biāo)儀對反應(yīng)結(jié)果OD值進(jìn)行讀數(shù)，根據(jù)公式計算結(jié)果，可以減少因人為觀察所造成的誤差。

1.4.4 PCR PCR方法一般用來檢測抗原，如副豬嗜血桿菌病二價滅活疫苗(4型JS株+5型ZJ株) 是進(jìn)行鼻拭子采樣后通過PCR方法進(jìn)行實驗動物篩選[10]。在目前已有的檢測方法中，PCR的敏感性最高。但是PCR方法操作相對復(fù)雜，在采樣后需要進(jìn)行增菌培養(yǎng)，然后離心將菌體重懸作為模板，按規(guī)定體系反應(yīng)后通過瓊脂糖凝膠電泳確定結(jié)果。且在整個實驗過程中需用到PCR儀、搖床、電泳系統(tǒng)和凝膠成像系統(tǒng)，對實驗室硬件設(shè)施要求較高。

在實際實驗動物篩選的過程中，有時也會同時用到多種篩選方法。如副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗(4型SH株+5型GD株+12型JS株)[11]，由于篩選要求需要抗原抗體雙陰性，所以同時采用了PCR和凝集兩種方法。

1.4.5 群體篩選 上述幾種方法均為針對動物個體進(jìn)行篩選。除個體篩選以外，部分產(chǎn)品也會應(yīng)用到群體篩選方法。在豬萎縮性鼻炎滅活疫苗(TK-MB6株+TK-MD8株)安全檢驗實驗動物篩選過程中，選取3～5頭符合標(biāo)準(zhǔn)的豬進(jìn)行剖檢，觀察肺部和鼻甲骨，以此來確定備選豬群是否符合要求[12]。鴨傳染性漿膜炎三價滅活疫苗(1型 YBRA01株+2型 YBRA02株+4型 YBRA04株)以不低于使用鴨數(shù)量20%的比例對鴨群抽樣，通過采取收集血清篩選合格后來確定本批鴨是否符合要求，最后選取未采血鴨作為實驗動物[13]。

產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中尚未明確“群體篩選”這一概念，只在實際應(yīng)用中以樣品代表群體。在進(jìn)行群體篩選的過程中，應(yīng)注意檢測樣品背景和來源相同，如多個來源，應(yīng)對不同來源背景的動物群體分別抽樣進(jìn)行篩選。

1.5 實驗動物的觀察 在接種疫苗前，需要對實驗動物進(jìn)行為期1～3 d的觀察，使其充分適應(yīng)新環(huán)境。在接種疫苗后需觀察6～21 d，以10 d、14 d居多。觀察6 d的如布氏桿菌活疫苗，21 d的如仔豬副傷寒活疫苗。2020版《中國獸藥典》中對免疫后實驗動物的觀察時間做了規(guī)定，如小鼠、豚鼠、兔等觀察時間不低于6 d，禽類和大動物觀察時間不低于7 d。大部分產(chǎn)品觀察指標(biāo)為健活，即動物存活且保持健康。健活的具體要求包括“注射部位無炎癥”、“未出現(xiàn)疫苗引起的局部或全身不良反應(yīng)”等?！敖』睢笔亲罨竞啽愕挠^察指標(biāo)，對于部分以本動物進(jìn)行安全檢驗的產(chǎn)品，還需要用到其他方法。

1.5.1 剖檢法 剖檢法多數(shù)針對不致死但感染動物特定部位的病原，通過剖檢后觀察病原感染部位的病變程度來確定產(chǎn)品是否安全。如雞毒支原體活疫苗安全檢驗，需要對實驗雞氣囊進(jìn)行剖檢，應(yīng)無臨床損傷。剖檢法有時候還需要輔以記分法，根據(jù)分值進(jìn)行更精確的判定。

1.5.2 測溫法 測溫法一般需要在接種疫苗前3～5 d進(jìn)行體溫測定，取其平均值作為基礎(chǔ)體溫。然后在疫苗接種后進(jìn)行體溫測定。一般體溫升高不超過一定值或者升高后在規(guī)定天數(shù)內(nèi)恢復(fù)即為正常。不同產(chǎn)品的體溫具體觀測方法略有不同，如豬敗血性鏈球菌病活疫苗(ST171株)是在14～21 d進(jìn)行觀察，體溫超過正常1 ℃不應(yīng)超過3 d。而豬鏈球菌病滅活疫苗(馬鏈球菌獸疫亞種+豬鏈球菌2型)則是在前三日進(jìn)行觀察，體溫不超過1 ℃。測溫法可以根據(jù)動物的體溫反應(yīng)來確定疫苗的安全性，一般以本動物、大動物為主。

1.5.3 記分法 記分法是根據(jù)動物接種疫苗后反應(yīng)或剖檢后感染部位的病變程度來賦予分值，根據(jù)分值來確定動物是否符合要求。如豬大腸桿菌病、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌病、諾維氏梭菌病三聯(lián)滅活疫苗就是根據(jù)動物的臨床反應(yīng)判定分值，進(jìn)而確定產(chǎn)品是否符合要求[14]。在動物剖檢觀察方面，應(yīng)用記分法較多的是寄生蟲類產(chǎn)品。如雞球蟲病四價活疫苗，在接種疫苗后剖檢，分別在幾種寄生蟲適宜寄生部位進(jìn)行觀察記分，根據(jù)分值來確定產(chǎn)品是否符合要求。

2 歐美相關(guān)法規(guī)概述

美國9CFR中，對細(xì)菌類動物疫苗安全檢驗免疫劑量的規(guī)定與《中國獸藥典》略有不同，根據(jù)不同實驗動物制定安全檢驗方法。對于小鼠和豚鼠等替代動物，以體積為單位進(jìn)行免疫；對于非替代動物，按一倍或多倍使用劑量進(jìn)行免疫。禽用疫苗的安全檢驗則是與效力檢驗合并進(jìn)行，通過觀察效力檢驗接種后動物的反應(yīng)來檢驗疫苗的安全性[15]。美國9CFR還對細(xì)菌類疫苗和病毒類疫苗的免疫劑量上加以區(qū)分，如豬和綿羊安全檢驗，細(xì)菌疫苗接種2頭份，病毒疫苗接種10頭份，但對活疫苗和滅活疫苗并沒有明確接種劑量的不同。

針對國內(nèi)外差異，可在后期的修訂工作中有針對地進(jìn)行研究論證。比如，以小鼠動物替代豬等大動物時，由于動物體重相差巨大，以豬的使用劑量做為接種小鼠的參考單位是否具有實際意義。美國9CFR禽用疫苗安全檢驗效力檢驗合并，節(jié)省了實驗動物數(shù)量，但是在安全檢驗免疫劑量即使用劑量的前提下。對于安全檢驗高于使用劑量的接種劑量對產(chǎn)品質(zhì)量控制的必要性論證，也可以作為一個研究方向。值得注意的是，《歐洲藥典》在對實驗動物的要求中規(guī)定了最小使用日齡[16]，而《中國獸藥典》在實驗動物中規(guī)定了日齡或體重范圍，卻沒有明確規(guī)定使用最小使用日齡或體重的實驗動物。針對這方面的差異，也可作為后期藥典修訂工作中的一個研究方向。

3 安全檢驗中存在的問題

3.1 替代動物的使用 在安全檢驗過程中，小鼠操作簡便且成本較低，是優(yōu)先考慮的替代動物。但因替代動物與本動物易感性和體重差異巨大，建立對比關(guān)系難以準(zhǔn)確把握。豬丹毒活疫苗G4T10株是經(jīng)歷市場考驗的經(jīng)典產(chǎn)品，但在近些年的安全檢驗項目中，以小鼠為實驗動物不合格率較高。由于使用豬進(jìn)行安全檢驗結(jié)果合格，故推斷當(dāng)前小鼠的集約化飼養(yǎng)方式可能導(dǎo)致了小鼠敏感性的變化，具體原因還需要進(jìn)一步實驗來驗證。

3.2 實驗動物篩選方法有待進(jìn)一步研究和規(guī)范 近些年通過新獸藥注冊的產(chǎn)品一般附加了詳細(xì)的動物篩選方法，但對于同種產(chǎn)品，不同研發(fā)單位的篩選方法不同，評價方法也不同，缺少針對同類產(chǎn)品的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。部分收錄在《中國獸藥典》中的產(chǎn)品，沒有明確動物篩選方法。根據(jù)常規(guī)的實驗室方法進(jìn)行抗原或抗體的檢測雖然可以達(dá)到篩選目的，但缺少具體依據(jù)。應(yīng)不斷規(guī)范和完善實驗動物篩選方法，針對同類產(chǎn)品，建立統(tǒng)一的評價標(biāo)準(zhǔn)，為安全檢驗結(jié)果提供依據(jù)。

3.3 檢測技術(shù)有待進(jìn)一步加強(qiáng) 目前企業(yè)自主研發(fā)的疫苗產(chǎn)品，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參考農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告。在監(jiān)管過程中，缺少現(xiàn)實可行的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，依賴企業(yè)提供的菌毒種、試劑和方法等。特別是對于進(jìn)口產(chǎn)品，難以做到有效監(jiān)管。針對這種情況，應(yīng)對特定病原加強(qiáng)通用檢驗方法研究，完善質(zhì)量控制方法，為實際監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

4 展 望

在養(yǎng)殖業(yè)中，針對細(xì)菌感染，往往使用抗生素即可達(dá)到治療的目的，這使細(xì)菌類動物疫苗在很長時間內(nèi)占國內(nèi)市場比重不大。但是，近年來，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大力推進(jìn)獸藥“減抗”，細(xì)菌類動物疫苗的重要性在一定程度上有所提升。同時，這也對細(xì)菌類動物疫苗的技術(shù)評價和監(jiān)管提出了新的要求。隨著我國經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，獸用生物制品領(lǐng)域技術(shù)也是日新月異。疫苗在生產(chǎn)、檢驗過程中涉及的原輔材料工藝不斷更新的同時對疫苗本身和檢驗過程可能有潛在影響，從而影響最終檢驗結(jié)果。一些歷經(jīng)考驗的經(jīng)典產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)是上一代獸醫(yī)學(xué)者留下的寶貴財富，應(yīng)不斷研究和完善，使其可以適應(yīng)新的技術(shù)環(huán)境。

雖然在動物疫苗安全檢驗中還存在諸多問題，但是隨著獸藥質(zhì)量控制體系的不斷完善，安全檢驗整體在不斷往規(guī)范化前進(jìn)。在檢驗技術(shù)的不斷提高和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善的背景下，相信動物疫苗安全檢驗的標(biāo)尺會在產(chǎn)品質(zhì)控中發(fā)揮越來越重要的作用。