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        22味中藥及其復(fù)方對(duì)奶牛乳房炎病原菌金黃色葡萄球菌的體外抑菌試驗(yàn)研究

        2022-10-25 00:53:44葉建新陳星宇張成宇李昭龍王冠男程曉薇于忠娜
        中國(guó)獸藥雜志 2022年9期
        關(guān)鍵詞:單味金黃色黃芩

        葉建新,陳星宇,張成宇,趙 雙,李昭龍,王冠男,程曉薇,于忠娜,于 雷

        (青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院,山東萊陽(yáng) 265200)

        奶牛乳房炎是危害全世界奶牛的主要疾病之一[1],也是影響奶牛健康和乳制品安全的關(guān)鍵因素[2]。乳房?jī)?nèi)細(xì)菌性感染被認(rèn)為是奶牛乳房炎的主要原因。其中,金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的主要傳染性病原體之一[3],也是一種常見的食源性致病微生物。奶牛感染金黃色葡萄球菌引發(fā)的乳房炎通常是慢性感染[4],雖然不會(huì)導(dǎo)致奶牛的異常或死亡,但由該菌產(chǎn)生的降解酶和毒素會(huì)不可逆地?fù)p害乳房組織[5],最終降低產(chǎn)奶量。目前,應(yīng)用抗生素仍是奶牛乳房炎的主要治療策略[6]。但使用抗生素治療由金黃色葡萄球菌引發(fā)的感染,會(huì)使該菌產(chǎn)生生物膜并適應(yīng)宿主環(huán)境[7-8],產(chǎn)生耐藥性[9],從而增加治療難度。此外抗生素會(huì)在奶牛體內(nèi)產(chǎn)生不同程度的藥物殘留,這不僅制約了我國(guó)畜牧業(yè)的健康發(fā)展,也將危害人們的日常飲食健康[10]。

        我國(guó)中草藥資源豐富,且中草藥具有毒副作用小、藥物殘留少等優(yōu)點(diǎn),且中草藥的活性物質(zhì)具有抗菌、消炎和免疫調(diào)節(jié)等作用。使用中草藥代替抗生素在如今的無抗時(shí)代是大勢(shì)所趨,可以從根本上提高牛奶品質(zhì),提高畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益[11]。試驗(yàn)選取并研究了22味中草藥及其復(fù)方對(duì)金黃色葡萄球菌的體外抑菌效果,為進(jìn)一步研發(fā)防治金黃色葡萄球菌引起的乳房炎中草藥制劑及實(shí)際臨床應(yīng)用提供參考資料。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)菌株 金黃色葡萄球菌,分離自山東省煙臺(tái)市某奶牛場(chǎng)患乳房炎奶樣,由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室鑒定、保存并贈(zèng)送。

        1.2 試驗(yàn)藥物 黃芩、鉤藤、王不留行、菊花、神曲、紅花、白頭翁、金銀花、獨(dú)活、大黃、山藥、桃仁、黃柏、丹皮、藿香、甘草、柴胡、白術(shù)、黃芪、蒲公英、地榆、厚樸共22味中藥,均購(gòu)自于山東省萊陽(yáng)市棗行藥店。

        1.3 試劑和儀器 LB培養(yǎng)基,購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司;恒溫培養(yǎng)箱(WJ-3-160),購(gòu)自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD),購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;恒溫?fù)u床(SHAKE SCS-24),購(gòu)自上海市離心機(jī)械研究所有限公司;常規(guī)儀器與試劑,均由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

        1.4 菌液活化及濃度的測(cè)定 金黃色葡萄球菌的分離活化,參考文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行,將冷凍保存的菌種劃線接種至平板培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)24 h;挑取單個(gè)菌落接種至5 mL液體培養(yǎng)基,37 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)16 h。每隔2 h用分光光度計(jì)在600 nm測(cè)定OD值,確定細(xì)菌的對(duì)數(shù)期,參考文獻(xiàn)[13]的方法,利用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定菌落數(shù),調(diào)整菌液的濃度為2x109CFU·mL-1。

        1.5 中藥的制備 稱取各中藥20 g置于燒杯中加入300 mL蒸餾水,浸泡1 h后,倒入鍋中武火加熱至沸騰,隨后文火加熱50 min。加熱后用8層紗布過濾,取出藥渣,再加入300 mL蒸餾水,倒入鍋中,步驟同上。合并兩次濾液,加熱濃縮至1 g·mL-1,室溫放置12 h,6 000 r·min-1離心5 min,取上清液,高壓滅菌,在4 ℃冰箱中保存。

        1.6 藥敏片的處理 參考文獻(xiàn)[14]的方法,取22味中藥提取液各1 mL于1.5 mL離心管中,分別放入10片藥敏片,充分浸泡24 h后,轉(zhuǎn)移至玻璃平皿中并將藥敏片不重疊的擺平分開。放入37 ℃恒溫箱烘干24 h后做好標(biāo)記,放入4 ℃冰箱備用。

        1.7 中藥抑菌試驗(yàn)及復(fù)方的抑菌試驗(yàn)

        1.7.1 單味中藥的抑菌試驗(yàn) 取20 μL稀釋后的菌液(2x108CFU·mL-1)于培養(yǎng)皿中,用涂布棒均勻涂布,用鑷子在酒精燈火焰上消毒后,夾取處理過的藥敏片放入培養(yǎng)皿中,按平按實(shí),并在平板底部做好標(biāo)記。用封口膜對(duì)培養(yǎng)皿進(jìn)行封口處理,倒置平板,放入恒溫箱37 ℃培養(yǎng)24 h。每種藥物3個(gè)重復(fù),取平均值。參照文獻(xiàn)[15]的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn):抑菌圈大于15 mm時(shí)判定為高敏,介于10~15 mm時(shí)判定為中敏;小于10 mm時(shí)判定為低敏。

        1.7.2 中藥復(fù)方的篩選及抑菌試驗(yàn) 把地榆、黃芩、白術(shù)、丹皮提取液按2∶2∶2∶1、4∶4∶4∶1、2∶2∶1∶2、4∶4∶1∶4、2∶1∶2∶2、4∶1∶4∶4、1∶2∶2∶2、1∶4∶4∶4的比例配伍,制備復(fù)方中藥的水提液,并依次命名為復(fù)方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ,各復(fù)方藥物濃度均為1 g·mL-1,6000 r·min-1離心5 min,過濾后高壓滅菌,置于4 ℃保存。中藥復(fù)方的藥敏片處理與1.5相同;復(fù)方中藥的抑菌試驗(yàn)與1.6.1相同。

        1.7.3 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[16]在1~7號(hào)管和9號(hào)管各加入0.1 mL稀釋好的菌液(2x108CFU·mL-1),37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,具體步驟見表1,24 h后將制備好的菌液涂布于培養(yǎng)基上,置于37 ℃恒溫箱18 h,以菌落分散生長(zhǎng)的視為有抑菌效果,此時(shí)最低藥物濃度值為其MIC值;以肉眼觀察無菌落生長(zhǎng)的為100 %被殺滅,此時(shí)最低藥物濃度值為MBC。

        表1 二倍稀釋法Tab 1 Double dilution method

        2 結(jié)果與分析

        2.1 單味中藥抑菌試驗(yàn)結(jié)果 由表2可見,22味中藥中篩選出對(duì)奶牛乳房炎致病菌金黃色葡萄球菌有抑菌作用的有13種,其中黃芩和地榆的抑菌效果最佳,抑菌圈直徑分別為18.30±1.02 mm和18.32±1.00 mm,均屬于高度敏感;黃柏、丹皮、甘草、白術(shù)、獨(dú)活共5味中藥均屬中度敏感,抑菌圈直徑分別為11.88±0.36 mm、13.34±0.56 mm、10.60±0.26 mm、14.48±0.66 mm和11.30±0.58 mm;藿香、柴胡、黃芪、蒲公英、菊花、金銀花共6味中藥屬低度敏感;其余9種無抑菌效果。

        表2 單味中藥抑菌結(jié)果(mm)Tab 2 Antibacterial test results of single traditional Chinese medicine(mm)

        2.2 復(fù)方中藥抑菌試驗(yàn)結(jié)果 由表3可見,所有復(fù)方對(duì)奶牛乳房炎致病菌金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出一定的抑菌效果,且均為高度敏感。

        表3 復(fù)方中藥抑菌試驗(yàn)結(jié)果(mm)Tab 3 Antibacterial test results of compound traditional Chinese medicine(mm)

        2.3 單味中藥MIC和MBC測(cè)定結(jié)果 22味中藥中,地榆的MIC值為31.25 mg·mL-1,MBC值為31.25 mg·mL-1,抑菌和殺菌效果較其他單味中藥強(qiáng),其次是黃芩和白術(shù)。具體數(shù)據(jù)見表4。

        表4 單味中藥MIC和MBC測(cè)定結(jié)果(mg·mL-1)Tab 4 Determination results of MIC and MBC of single traditional Chinese medicine(mg·mL-1)

        2.4 中藥復(fù)方MIC和MBC測(cè)定結(jié)果 八種中藥復(fù)方制劑中復(fù)方Ⅱ和復(fù)方Ⅶ的抗菌和殺菌能力較強(qiáng),其MIC和MBC均為31.25 mg·mL-1;其余中藥復(fù)方也有一定抑菌效果。具體數(shù)據(jù)見表6。

        表5 中藥復(fù)方MIC和MBC測(cè)定結(jié)果(mg·mL-1)Tab 5 Determination results of MIC and MBC of traditional Chinese medicine compound(mg·mL-1)

        3 討論與結(jié)論

        研究發(fā)現(xiàn)單味中藥中黃芩和地榆水提液對(duì)金黃色葡萄球菌體外抑菌呈高度敏感,左國(guó)營(yíng)等人[17]的結(jié)果也顯示地榆、黃芩兩種藥物對(duì)金黃色葡萄球菌有較好的抑菌效果。研究證實(shí),黃芩的主要抑菌成分是黃芩苷和黃芩素,其中黃芩素能夠抑制細(xì)菌形成生物保護(hù)膜,削弱細(xì)菌的自我保護(hù)能力,并通過干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)合成和抑制三羧酸循環(huán)達(dá)到抑菌作用,黃芩不僅作為單味藥發(fā)揮抑菌作用明顯,與其它中藥配伍時(shí)還能起到良好的協(xié)同作用[18]。鞣質(zhì)、酚酸類、皂苷類及黃酮類成分是地榆發(fā)揮其抑菌效果的主要活性成分[19]。地榆可能是通過提高金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的通透性,破壞細(xì)菌整體的穩(wěn)定性和完整性,利于鞣質(zhì)等抑菌成分進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部,從而發(fā)揮抑菌作用。本試驗(yàn)中白術(shù)、丹皮對(duì)金黃色葡萄球菌也具有較好的抑菌效果,這與前人[20-21]的研究結(jié)果一致。白術(shù)主要是通過揮發(fā)性油和多糖類成分進(jìn)行抑菌,白術(shù)揮發(fā)油對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌、金黃色葡萄球菌和草綠色鏈球菌的抑菌作用明顯[22]。本試驗(yàn)采用水煎法熬制中藥,無法獲得白術(shù)揮發(fā)油,證實(shí)白術(shù)水提液對(duì)金黃色葡萄球菌也具有較好的抑菌作用,但其抑菌機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

        試驗(yàn)采用二煎法水煎的方式熬制提取中藥,但是各類中藥性狀、結(jié)構(gòu)不同,僅用傳統(tǒng)水煎方法提取出的中藥有效成分有所差異,水溶性成分并不是所有中藥的有效抑菌成分,采取水煎法所提取的藥液并不能完全發(fā)揮出所選取中藥的真正抑菌效果,可能得到的水提藥液中僅是一般化學(xué)成分,或是活性成分的前體成分,其對(duì)試驗(yàn)結(jié)果存在不同程度的影響。本試驗(yàn)中所得的中藥抑菌圈直徑與相關(guān)文獻(xiàn)[23-25]有一定差異,可能是菌株的來源不同、中藥的提取方法不同、抑菌試驗(yàn)采用的方法不同而造成結(jié)果上的差異。此外,本研究中單味中草藥對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果測(cè)定結(jié)果多為低敏或不敏感,可能是單味中藥藥敏試驗(yàn)中所選的濃度過低所致,還需要調(diào)整藥液濃度進(jìn)一步研究,篩選出對(duì)病原菌有抑菌效果的藥液濃度。

        研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方藥的抑菌效果普遍強(qiáng)于單味藥,可能是所選中藥之間發(fā)揮協(xié)同抑菌作用;但復(fù)方藥中也存在抑菌效果弱于單味藥,可能是復(fù)方藥中僅單味中藥發(fā)揮抑菌作用或某幾種中藥出現(xiàn)拮抗抑菌作用。各類中藥對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)制各不相同,從而產(chǎn)生的抑菌效果也存在差異。因此挑選合適的,具有高效抑菌的中藥具有非常重要的臨床價(jià)值。而通過組合、配伍將不同的單味藥形成副作用小、抑菌效果好的復(fù)方中藥仍然需要不懈的深入研究,在當(dāng)今國(guó)家嚴(yán)格管控抗生素使用的背景下,本試驗(yàn)為臨床上研究防治奶牛乳房炎致病菌中金黃色葡萄球菌的中藥復(fù)方提供參考。由于中藥種類較多,有效成分復(fù)雜,其復(fù)方的配比和復(fù)方之間抑菌作用的相互影響還有待進(jìn)一步研究。

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