黃小潔，吳華偉，張 兵，楊承槐，孔冬妮，侯力丹，楊 飛，薛 麒*，劉 丹*

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081;2.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市獸用多肽疫苗設(shè)計(jì)與制備工程技術(shù)中心，北京100095)

雞傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的雞和火雞的急性、高度接觸性傳染病[1],IBDV屬雙RNA病毒科雙RNA病毒屬。該病與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥、禽白血病、雞傳染性貧血病并稱為危害雞免疫系統(tǒng)的四大病毒性疾病[2]。該病主要感染3周齡以內(nèi)的雞,雞群被感染后會(huì)造成中樞免疫器官法氏囊的損傷，從而引起免疫抑制，進(jìn)而引起疫苗免疫失敗或繼發(fā)其他病毒性、細(xì)菌性疾病，嚴(yán)重的可以導(dǎo)致雞群大量死亡，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。自從IBDV發(fā)現(xiàn)至今，雞傳染性法氏囊病目前幾乎遍及世界上所有養(yǎng)雞國(guó)家和地區(qū)，已成為危害養(yǎng)雞業(yè)的重要疾病之一。

目前防控IBDV最有效的方法就是疫苗免疫，但由于IBDV基因組易發(fā)生基因突變，不同毒株交叉感染還易發(fā)生基因組重配，造成疫苗免疫失敗[4]。因此，在使用IBDV疫苗免疫后，對(duì)雞群免疫后的保護(hù)性抗體水平進(jìn)行評(píng)價(jià)，也是當(dāng)前IBD防控工作中的重要課題。IBDV抗體的檢測(cè)方法主要有中和試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)[5]。中和試驗(yàn)是評(píng)價(jià)雞群抗體的金標(biāo)準(zhǔn)，但操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，且需要用細(xì)胞培養(yǎng)，普通養(yǎng)殖場(chǎng)很難開展操作。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，但耗時(shí)較長(zhǎng)，不符合快速檢測(cè)的要求。IFA操作繁瑣，需要用細(xì)胞培養(yǎng)，且觀察需要用的熒光顯微鏡，既不方便也價(jià)格昂貴。而ELISA檢測(cè)方法具有特異性好、操作簡(jiǎn)便、快速的優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為近年來研究的熱點(diǎn)。

本研究選用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)IBDV的VP2蛋白作為包被抗原[6]，建立了檢測(cè)IBDV抗體的間接ELISA方法，為IBDV流行病學(xué)調(diào)查和隱性感染監(jiān)測(cè)提供有效的監(jiān)測(cè)手段，為試劑盒的研制提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 IBDV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清及陰性血清、雞減蛋綜合征病毒(EDSV)陽性血清、雞新城疫病毒(NDV)陽性血清、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)陽性血清、雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)陽性血清、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)陽性血清和馬立克氏病火雞皰疹病毒(HVT)陽性血清、雞大腸桿菌陽性血清購自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；禽流感病毒(AIV，H5、H9)陽性血清購自哈爾濱獸醫(yī)研究所；375份臨床血清采自SPF雞；HRP標(biāo)記的Donkey anti-chicken IgY購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；TMB由Sigma公司提供；酶標(biāo)板為Corning公司產(chǎn)品；IBD ELISA抗體檢測(cè)試劑盒為IDEXX公司產(chǎn)品。

1.1.2 IBDV VP2蛋白的制備 參照文獻(xiàn)[6]，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行VP2蛋白表達(dá)，純化后的蛋白濃度為800 μg/mL，將純化后的蛋白定量后作為ELISA包被用抗原。

1.2 方法

1.2.1 抗原包被濃度和待檢血清稀釋度的確定 用PBS將純化后蛋白進(jìn)行倍比稀釋，取8、4、2、1、0.5 μg/mL 5個(gè)濃度，100 μL/孔包被酶標(biāo)板，37 ℃ 1 h后 4 ℃過夜。洗滌后加入10%脫脂乳，每孔200 μL，37 ℃封閉1 h。洗滌拍干后分別加入1∶100、1∶200、1∶400、1∶800稀釋的 IBD 陽性血清和陰性血清進(jìn)行ELISA方陣試驗(yàn)，100 μL/孔，37 ℃ 1 h，洗滌后加入1∶1800稀釋的酶標(biāo)抗體，100 μL/孔，37 ℃ 1 h；洗滌后加入TMB 底物溶液，100 μL/孔，37 ℃ 10 min，50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD450nm值，每個(gè)稀釋度做2個(gè)重復(fù)，取其平均值。以陽性血清的OD450nm值接近1.0、P/N值最大的所在孔的抗原濃度和血清稀釋倍數(shù)作為最佳抗原工作濃度和血清稀釋度。

1.2.2 酶標(biāo)抗體稀釋度的確定 固定抗原包被濃度和待檢血清稀釋度，將HRP標(biāo)記的驢抗雞酶標(biāo)抗體稀釋為1∶10000、1∶12000、1∶15000、1∶18000、1∶20000，按照ELISA程序進(jìn)行檢測(cè)，篩選酶標(biāo)抗體的最佳稀釋度。

1.2.3 封閉液的確定 以1% BSA、10%脫脂乳、10%馬血清、3%明膠，1% OVA封閉包被板，用IBDV標(biāo)準(zhǔn)陰性、陽性血清進(jìn)行檢測(cè)，以確定最佳包被液。

1.2.4 最佳包被條件的確定 分別選擇4 ℃過夜、37 ℃ 1 h+4 ℃過夜、37 ℃ 2 h三個(gè)反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè)，以確定最佳包被條件。

1.2.5 抗原稀釋液的確定 分別用0.01 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6)和0.01 mol/L PBS(pH7.2)稀釋VP2蛋白進(jìn)行檢測(cè)，確定抗原稀釋液。

1.2.6 ELISA反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

1.2.6.1 待檢血清反應(yīng)時(shí)間的確定 加入最佳稀釋度的IBDV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清，按作用時(shí)間分別為37 ℃ 30 min、37 ℃ 60 min、37 ℃ 90 min及37 ℃ 120 min進(jìn)行ELISA檢測(cè)，確定血清最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.2.6.2 酶標(biāo)抗體作用時(shí)間的確定 加入酶標(biāo)抗體后，分別按37 ℃ 30 min、37 ℃ 60 min、37 ℃ 90 min及37 ℃ 120 min進(jìn)行ELISA檢測(cè)，確定酶標(biāo)抗體最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.2.6.3 底物反應(yīng)時(shí)間的確定 加入底物后，按室溫10、15、20 min進(jìn)行反應(yīng)，以P/N值最高確定最終反應(yīng)時(shí)間。

1.2.7 陰陽性臨界值的確定 按照已建立的IBDV抗體間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。通過對(duì)375份陰性雞血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算陰性血清的OD450nm平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，將平均值+3×標(biāo)準(zhǔn)差作為判斷陰陽性血清臨界值的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.8 特異性試驗(yàn) 用已建立的IBDV抗體間接ELISA檢測(cè)方法對(duì)抗EDSV、NDV、IBV、ILTV、REV、ALV(H5)、ALV(H9)和HVT等8種禽常見傳染病病毒陽性血清和雞大腸桿菌陽性血清進(jìn)行測(cè)定，評(píng)價(jià)該IBDV抗體間接ELISA檢測(cè)方法的特異性。

1.2.9 敏感性試驗(yàn) 取4份IBDV陽性血清，分別進(jìn)行1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200稀釋后進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)與IDEXX公司生產(chǎn)的IBDV抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行比較，以評(píng)價(jià)IBDV抗體間接ELISA檢測(cè)方法的敏感性。

1.2.10 重復(fù)性試驗(yàn)

1.2.10.1 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次三塊ELISA板，對(duì)4份陽性血清、4份陰性血清進(jìn)行ELISA測(cè)定，每個(gè)平行做3孔，進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析、計(jì)算變異系數(shù)。

1.2.10.2 批間重復(fù)性試驗(yàn) 不同時(shí)間制備的三批抗原包被的ELISA板，對(duì)4份陽性血清、4份陰性血清進(jìn)行ELISA測(cè)定，每個(gè)平行做3孔，進(jìn)行批間重復(fù)性試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析、計(jì)算變異系數(shù)。

1.2.11 與IDEXX公司的IBDV抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行符合率比較 用已建立的IBDV抗體間接ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)不同抗體效價(jià)的血清184份，同時(shí)將這些血清按照IDEXX公司的IBDV抗體檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)結(jié)果確定兩者之間的符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原包被濃度和待檢血清稀釋度的確定 ELISA方陣試驗(yàn)結(jié)果表明，在抗原的包被濃度為8 μg/mL，每孔100 μL，待檢血清稀釋度為1∶400時(shí)，陽性血清OD450nm在1.0左右，且P/N值最大(表1)。

表1 抗原包被濃度和待檢血清稀釋度的確定Tab 1 Determination of antigen concentration and serum dilution

2.2 酶標(biāo)抗體稀釋度的確定 在最適抗原包被濃度和待檢血清最佳稀釋度條件下，將HRP標(biāo)記的驢抗雞酶標(biāo)抗體稀釋為1∶10000、1∶12000、1∶15000、1∶18000、1∶20000，按照ELISA程序檢測(cè)，結(jié)果表明酶標(biāo)抗體的最佳稀釋度為1∶15000(表2)。

表2 不同酶標(biāo)抗體稀釋度的ELISA結(jié)果Tab 2 ELISA results of dilution of different enzyme-labeled antibodies

2.3 封閉液的確定 分別以1%BSA、10%脫脂乳、10%馬血清、3%明膠、1% OVA封閉包被板，用IBDV標(biāo)準(zhǔn)陰性、陽性血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示10%馬血清的封閉效果最好(表3)。

表3 不同封閉液條件的ELISA結(jié)果Tab 3 ELISA results of different sealing fluid

2.4 最佳包被條件的確定 分別選擇4 ℃過夜、37 ℃ 1 h+4 ℃過夜、37 ℃ 2 h三個(gè)反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示4 ℃過夜、37 ℃ 1 h+4 ℃過夜效果較好，確定最佳包被條件為4 ℃過夜(表4)。

表4 不同包被條件的ELISA結(jié)果Tab 4 ELISA results of different coating conditions

2.5 抗原稀釋液的確定 分別用0.01 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6)和0.01 mol/L PBS(pH7.2)稀釋VP2蛋白進(jìn)行檢測(cè)，兩者差異不大，選擇常用的0.01 mol/L PBS(pH7.2)作為抗原稀釋液(表5)。

表5 不同抗原稀釋液的ELISA結(jié)果Tab 5 ELISA results of different Antigen Diluents

2.6 待檢血清反應(yīng)時(shí)間的確定 加入最佳稀釋度的IBDV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清，按作用條件分別為37 ℃ 30 min、37 ℃ 60 min、37 ℃ 90 min及37 ℃ 120 min進(jìn)行ELISA檢測(cè)，確定血清最佳反應(yīng)時(shí)間為90 min(表6)。

表6 不同血清反應(yīng)時(shí)間的ELISA結(jié)果Tab 6 ELISA results of different serum reaction time

2.7 酶標(biāo)抗體作用時(shí)間的確定 加入酶標(biāo)抗體后，分別按37 ℃ 30 min、37 ℃ 60 min、37 ℃ 90 min及37 ℃ 120 min進(jìn)行ELISA檢測(cè)，確定酶標(biāo)抗體最佳反應(yīng)時(shí)間為37 ℃ 60 min(表7)。

表7 不同酶標(biāo)抗體作用時(shí)間的ELISA結(jié)果Tab 7 ELISA results of different enzyme labeled antibody reaction time

2.8 底物反應(yīng)時(shí)間的確定 加入底物后，按室溫10、15、20 min進(jìn)行反應(yīng)，確定最終反應(yīng)時(shí)間為15 min(表8)。

表8 不同底物作用時(shí)間的ELISA結(jié)果Tab 8 ELISA results of different substrates reaction time

2.9 陰陽性臨界值的確定 按照已建立的IBDV抗體間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。通過對(duì)370份陰性雞血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算得到陰性血清的OD450 nm平均值為0.144，標(biāo)準(zhǔn)差為0.048，臨界值=平均值+3×標(biāo)準(zhǔn)差=0.144+3×0.044=0.288(表9)。

2.10 特異性試驗(yàn) 用已建立的IBDV抗體間接ELISA檢測(cè)方法對(duì)抗EDSV、NDV、IBV、ILTV、REV、ALV(H5)、ALV(H9)和HVT等8種禽常見傳染病病毒陽性血清和雞大腸桿菌陽性血清進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果均為陰性，證明無血清交叉反應(yīng)，建立的IBDV抗體間接ELISA檢測(cè)方法具有很好的特異性(表10)。

2.11 敏感性試驗(yàn) 表11結(jié)果表明，本試驗(yàn)建立的ELISA方法檢測(cè)1∶400至1∶1600倍稀釋的血清均為陽性，IDEXX公司生產(chǎn)的IBDV抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)的最高限1∶1600為陽性，說明兩者的敏感性相當(dāng)(表11)。

表11 ELISA方法敏感性試驗(yàn)結(jié)果Tab 11 The results of the sensitivity of ELISA method

2.12 重復(fù)性試驗(yàn)

2.12.1 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn) 結(jié)果見表12，變異系數(shù)為3.3%～7.3%，小于10%，表明有很好的批內(nèi)重復(fù)性。

2.12.2 批間重復(fù)性試驗(yàn) 結(jié)果見表12，變異系數(shù)為1.9%～6.0%，小于10%，表明有很好的批間重復(fù)性。

表12 ELISA方法批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)和批間重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Tab 12 The results of the repeated batch test and iner batch test

2.12.3 與IDEXX公司IBDV抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行符合率比較 結(jié)果見表13。建立的IBDV抗體間接ELISA檢測(cè)方法，檢測(cè)結(jié)果為陽性12份，陰性172份；IDEXX公司IBDV-ELISA抗體試劑盒的檢測(cè)結(jié)果為陽性14份陽性，陰性170份，符合率為95.7%。

表13 建立的間接ELISA方法與IDEXX-ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果比較Tab 13 Comparision the results of the indirect ELISA method with the IDEXX-ELISA kit

3 討 論

目前，商品化的IBD抗體間接ELISA試劑盒采用的是全病毒包被酶標(biāo)板，病毒的制備過程繁瑣，成本高，不利于推廣應(yīng)用，而且全病毒包被，有較強(qiáng)的背景反應(yīng)和非特異性反應(yīng)，易造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。在IBDV的5個(gè)病毒蛋白中，VP2和VP3蛋白均可以用來研制IBDV的抗體檢測(cè)試劑盒，VP2是病毒的衣殼蛋白，也是病毒的主要保護(hù)性抗原，有研究表明用VP2蛋白來研制IBDV抗體檢測(cè)試劑盒比VP3具有更好的優(yōu)勢(shì)[7-8]。雖然，IBD重組VP2蛋白可由多種表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)[9-12]，但若要研制IBDV抗體檢測(cè)試劑盒，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是首選，表達(dá)量高，生產(chǎn)和純化方便。為此，試驗(yàn)選用重組VP2蛋白作為包被抗原，并通過原核表達(dá)系統(tǒng)來制備，操作簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)，特異性高。

在對(duì)臨床樣品的檢測(cè)中，本方法跟IDEXX公司的試劑盒相比符合率很高，IDEXX試劑盒多檢出的兩份陽性樣品，用經(jīng)典的瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)方法(參照《中國(guó)獸藥典》2020年版三部)進(jìn)行復(fù)核，結(jié)果為陰性，與本方法檢測(cè)結(jié)果一致，說明本方法檢測(cè)準(zhǔn)確率高。酶標(biāo)液的選擇是影響ELISA試驗(yàn)特異性的主要因素[13]。研究使用10%的馬血清做為封閉液封閉酶標(biāo)板，大大降低了非特異性因素影響。包被抗原的濃度和陰陽性血清稀釋度是否適宜也影響ELISA試驗(yàn)特異性和敏感性，試驗(yàn)中陽性血清稀釋到1∶1600仍然能檢測(cè)出來，說明方法的敏感性非常好?？乖陌粷舛热绻?，蛋白分子間相互作用會(huì)造成分子的多層化，洗的時(shí)候這些蛋白容易被洗掉，造成試驗(yàn)的非特異性；濃度太低，載體表面吸附的抗原量太少，容易出現(xiàn)假陰性的情況，造成結(jié)果的不準(zhǔn)確。試驗(yàn)將包被抗原稀釋為8 μg/mL，每孔加入100 μL，試驗(yàn)的特異性最高。血清的稀釋度也直接影響試驗(yàn)的特異性和靈敏度。試驗(yàn)顯示，隨著血清稀釋度的增加，陽性樣品OD值有下降趨勢(shì)。而陰性樣品的OD值變化不大。可能是因?yàn)檠逯械鞍壮煞謴?fù)雜，有可能在ELISA反應(yīng)體系會(huì)出現(xiàn)非特異性反應(yīng)，因此對(duì)血清做適宜的稀釋可降低這種非特異性反應(yīng)。該方法與其他血清不出現(xiàn)交叉反應(yīng)，說明方法的特異性好。

本研究?jī)?yōu)化了間接ELISA方法的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，證明方法的敏感性高、特異性和重復(fù)性好，與國(guó)外同類型的商品化試劑盒的復(fù)合率高，初步建立了檢測(cè)IBDV抗體的間接ELISA方法，為商品化試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。