陳 說(shuō)， 張 帆， 范艷飛， 彭衛(wèi)群， 洪小瑜， 吳佩嫻

北京大學(xué)深圳醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東 深圳 518036

肥胖癥是一種由各種原因?qū)е轮窘M織在體內(nèi)過(guò)度蓄積的代謝障礙性疾病，一般以體質(zhì)量超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量10%～15%為界定肥胖的標(biāo)準(zhǔn)[1]。肥胖癥病因分為內(nèi)源性、外源性?xún)煞N因素，前者包括遺傳、內(nèi)分泌失調(diào)等，后者為攝入過(guò)多高碳水化合物、高脂肪食物或運(yùn)動(dòng)不足[2]。此外，Macchione等[3]報(bào)道，腸道菌群穩(wěn)態(tài)失衡也可誘發(fā)肥胖癥。當(dāng)前，許多研究[4-5]均指向通過(guò)藥物控制體質(zhì)量的研究方向，但實(shí)際上僅有小部分藥物被批準(zhǔn)用于臨床，且其潛在不良反應(yīng)不可避免。膽酸是動(dòng)物體內(nèi)膽固醇代謝時(shí)產(chǎn)生的固醇類(lèi)物質(zhì)，由于其經(jīng)膽囊與膽汁一同排泄至腸道，且具有酸性，故稱(chēng)為“膽酸”，多項(xiàng)報(bào)道[6-7]證明，其可促進(jìn)糖類(lèi)新陳代謝?，F(xiàn)階段，膽酸不僅是膽固醇代謝副產(chǎn)品，在膳食脂類(lèi)吸收與膽酸合成方面發(fā)揮重要作用，Sun等[8]報(bào)道，消融腸道微生物群可通過(guò)調(diào)節(jié)膽酸代謝來(lái)減輕肥胖所致脂肪肝和葡萄糖耐受不良等問(wèn)題。但膽酸對(duì)肥胖人群的腸道炎癥及其對(duì)生物群結(jié)構(gòu)的作用及其機(jī)制的報(bào)道較少見(jiàn)，故本研究以膳食膽酸為實(shí)驗(yàn)藥物，分析其對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠模型腸道的影響及可能機(jī)制，為營(yíng)養(yǎng)性肥胖治療研究新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，60只，7周齡，體質(zhì)量260～270 g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滇)K2019-0002]。實(shí)驗(yàn)開(kāi)展前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室溫度20～25 ℃，濕度40%～70%，自然光照，自由攝食、飲水。本實(shí)驗(yàn)全部操作符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.1.2 藥物、主要試劑和儀器：膳食膽酸(純度99.8%，西華天生物科技有限公司)，芬氟拉明片(北京曙光藥業(yè)有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H11021033，規(guī)格20 mg)。甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)，大鼠血清腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6) ELISA試劑盒(晶美生物工程有限公司)。兔抗大鼠G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體1(G-protein coupled bile acid receptor 1，GPBAR1/TGR5)、核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、GAPDH一抗(ABcam，貨號(hào)ab72608、ab145954、ab3486)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)ZB2306)。BS-800全自動(dòng)生化分析儀(邁瑞醫(yī)療國(guó)際股份有限公司)，164-5070蛋白電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模、分組和干預(yù)：取50只大鼠建造營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠模型[9]，予以高脂飼料(飼料組成：30%豬油、65%基礎(chǔ)飼料和5%蛋黃粉；主要營(yíng)養(yǎng)成分：蛋白質(zhì)20%、碳水化合物30%和脂肪35%)喂養(yǎng)，每日一次性提供足夠飼料，自由飲水，喂養(yǎng)12周后稱(chēng)重，若造模大鼠與健康大鼠體質(zhì)量差值/健康大鼠體質(zhì)量×100%>20%，表示造模成功。經(jīng)篩選獲得40只營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠，隨機(jī)分為模型組、低劑量組、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組，每組各10只。剩余10只設(shè)為健康組，予以基礎(chǔ)飼料(基礎(chǔ)飼料組成：玉米280 g/kg、麩皮300 g/kg、豆餅200 g/kg、小麥110 g/kg、魚(yú)粉80 g/kg、骨粉20 g/kg、食鹽1 g/kg、多維素0.075 g/kg和植物油500 ml，主要營(yíng)養(yǎng)成分：蛋白質(zhì)20%、碳水化合物35%和脂肪5%)喂養(yǎng)，1次/d。

造模成功后，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃4.16 mg/kg芬氟拉明(該劑量參考黃繼漢等[10]提出的“動(dòng)物與人每公斤體質(zhì)量折算系數(shù)6.25”計(jì)算所得)，低劑量組、高劑量組分別灌胃50、100 mg/kg膳食膽酸(用0.5%羥甲基纖維素鈉溶解)[11]，模型組和健康組灌胃等體積0.5%羥甲基纖維素鈉，1次/d，連續(xù)干預(yù)17 d。

1.2.3 ELISA檢測(cè)血清炎癥因子和血清生化指標(biāo)檢測(cè)：末次給藥后，麻醉大鼠，心臟采血，離心取上清，置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。一半血清樣品參考TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值，根據(jù)生存曲線(xiàn)計(jì)算各種大鼠血清TNF-α、IL-6水平。取剩余血清，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)TG、TC、HDL-C和LDL-C水平。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)腸道菌群結(jié)構(gòu)：取肛門(mén)到回盲腸部分結(jié)腸組織，取其內(nèi)含的新鮮糞便200 mg，加入70%乙醇1 ml，7 500 r/min離心5 min后棄上清，加PBS離心棄上清。將離心管置于吸水紙上，倒置無(wú)液體流出，在55 ℃烘箱內(nèi)放置10 min。用DNA提取試劑盒提取細(xì)菌總DNA，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行擴(kuò)增、純化。高通量測(cè)序上機(jī)操作，按照可操作分類(lèi)單元分類(lèi)物種，特定導(dǎo)出擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)樣品進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5 HE染色觀察脂肪細(xì)胞大?。盒呐K采血處死大鼠，剖腹分離出腎和睪丸周?chē)?，固定?0%多聚甲醛溶液，經(jīng)乙醇脫水、透明、浸蠟、包埋等一系列操作后，制作4 μm厚的切片。脫蠟至水，進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察組織上脂肪細(xì)胞大小變化。

1.2.6 Western blotting檢測(cè)大鼠結(jié)腸中TGR5、NF-κB蛋白表達(dá)：取結(jié)腸組織清洗干凈后，在加入液氮的研缽內(nèi)剪碎，加RIPA裂解液提取蛋白，BCA檢測(cè)蛋白濃度，加上樣緩沖液，沸水浴變性，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)PVDF膜，質(zhì)量濃度為50 g/L脫脂奶粉封閉2 h。加TGR5、NF-κB、GAPDH一抗(稀釋1∶1 000)過(guò)夜，次日加二抗(1∶2 000)孵育2 h。ECL曝光顯色，計(jì)算目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值比值。

2 結(jié)果

2.1 大鼠增重率和肥胖指數(shù)與健康組比較，模型組、低劑量組、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠增重率和肥胖指數(shù)較高(P<0.05)；與模型組比較，低劑量組、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠增重率和肥胖指數(shù)較低(P<0.05)；與低劑量組比較，高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠增重率和肥胖指數(shù)較低(P<0.05)；與高劑量組比較，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠增重率和肥胖指數(shù)較低(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

2.2 大鼠血清炎癥因子水平與健康組比較，模型組、低劑量組、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清TNF-α、IL-6水平較高(P<0.05)；與模型組比較，低劑量組、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清TNF-α、IL-6水平較低(P<0.05)；與低劑量組比較，高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清TNF-α、IL-6水平較低(P<0.05)；與高劑量組比較，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清TNF-α、IL-6水平較低(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

表1 各組大鼠增重率和肥胖指數(shù)Tab 1 Weight gain rate and obesity index of rats in each

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平Tab 2 Serum TNF-α and IL-6 levels of rats in

2.3 大鼠血脂水平各組大鼠血清HDL-C水平組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與健康組比較，模型組、低劑量組、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清TG、TC和LDL-C水平較高(P<0.05)；與模型組比較，低劑量組、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清TG、TC和LDL-C水平較低(P<0.05)；與低劑量組比較，高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清TG、TC和LDL-C水平較低(P<0.05)；與高劑量組比較，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清TG、TC和LDL-C水平較低(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 各組大鼠血清TG、TC、HDL-C和LDL-C水平Tab 3 Serum TG, TC, HDL-C and LDL-C levels of rats in each group mol/L)

2.4 大鼠腸道菌群中擬桿菌門(mén)與厚壁菌門(mén)比例與健康組比較，模型組、低劑量組、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠腸道中擬桿菌門(mén)比例較低，厚壁菌門(mén)比例較高(P<0.05)；與模型組比較，低劑量組、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠擬桿菌門(mén)比例較高，厚壁菌門(mén)比例較低(P<0.05)；與低劑量組比較，高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠擬桿菌門(mén)比例較高，厚壁菌門(mén)比例較低(P<0.05)；與高劑量組比較，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠擬桿菌門(mén)比例較高，厚壁菌門(mén)比例較低(P<0.05)(見(jiàn)表4)。

2.5 大鼠腎與睪丸周?chē)静±韺W(xué)健康組大鼠脂肪細(xì)胞體積較小，偏橢圓形。與健康組比較，模型組大鼠脂肪細(xì)胞形態(tài)飽滿(mǎn)，呈圓形，細(xì)胞壁模糊，細(xì)胞相交處可見(jiàn)有融合成大細(xì)胞團(tuán)的趨勢(shì)；與模型組比較，低劑量組、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞呈多角形，細(xì)胞體塌陷，體積較小，細(xì)胞壁清晰(見(jiàn)圖1)。

表4 各組大鼠腸道菌群中擬桿菌門(mén)與厚壁菌門(mén)

注：A：健康組；B：模型組；C：低劑量組；D：高劑量組；E：陽(yáng)性對(duì)照組。

2.6 大鼠結(jié)腸中TGR5、NF-κB蛋白表達(dá)與健康組比較，模型組、低劑量組、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠結(jié)腸中TGR5蛋白相對(duì)表達(dá)量較低，NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量較高(P<0.05)；與模型組比較，低劑量組、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組結(jié)腸中TGR5蛋白相對(duì)表達(dá)量較高，NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量較低(P<0.05)；與低劑量組比較，高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組結(jié)腸中TGR5蛋白相對(duì)表達(dá)量較高，NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量較低(P<0.05)；與高劑量組比較，陽(yáng)性對(duì)照組結(jié)腸中TGR5蛋白相對(duì)表達(dá)量較高，NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量較低(P<0.05)(見(jiàn)圖2、表5)。

注：A：健康組；B：模型組；C：低劑量組；D：高劑量組；E：陽(yáng)性對(duì)照組。

表5 大鼠結(jié)腸中TGR5、NF-κB蛋白表達(dá)Tab 5 Expressions of TGR5 and NF-κB proteins

3 討論

隨著人們生活水平提高和飲食習(xí)慣變化，全球范圍內(nèi)肥胖群體快速壯大，肥胖不但影響人們外形美觀和正常生活活動(dòng)，還與酒癮、艾滋病、毒藥麻痹并列為世界四大醫(yī)學(xué)社會(huì)問(wèn)題，危害人類(lèi)健康，亟需重視和解決。據(jù)Tilg等[12]報(bào)道，營(yíng)養(yǎng)性肥胖患者因機(jī)體攝入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不均衡導(dǎo)致腸道微生態(tài)環(huán)境失調(diào)，宿主在能量獲取和脂肪堆積上出現(xiàn)變化，削弱腸道屏障功能，激發(fā)炎癥通路，誘發(fā)腸道炎癥問(wèn)題。因此，抗炎是營(yíng)養(yǎng)性肥胖治療過(guò)程中的必要環(huán)節(jié)。膽酸不但有抗病毒、抗寄生蟲(chóng)和抗菌能力，還可加大脂肪在胰脂肪酶中的暴露面積，促進(jìn)脂肪分解和消化，兼顧抗炎和減肥的雙重功效。故本研究建立了營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠模型，通過(guò)補(bǔ)充膳食膽酸方式觀察大鼠生理病理變化，為膳食膽酸療法的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Jia等[13]認(rèn)為，膽酸可用于治療脂肪肝，在解決營(yíng)養(yǎng)性肥胖問(wèn)題上有一定作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，低、高劑量組大鼠增重率、肥胖指數(shù)較低，HE染色顯示腎與睪丸周?chē)炯?xì)胞較小，共同提示膽酸作為膳食添加劑使用時(shí)具備減肥作用，符合Jia等[13]的觀點(diǎn)。Desai等[14]提出的膽汁酸學(xué)說(shuō)證實(shí)了胃腸道微生態(tài)對(duì)代謝疾病的調(diào)控作用。Zhao等[15]報(bào)道腸道菌群紊亂與肥胖有密切關(guān)系，推測(cè)可能是因腸道菌群紊亂影響腸道功能，其中對(duì)肥胖微生物攝取能力較強(qiáng)的腸道菌群占據(jù)優(yōu)勢(shì)，導(dǎo)致脂肪大量聚集誘發(fā)肥胖。腸道菌群紊亂不但影響脂肪存儲(chǔ)，還干擾血脂代謝功能，如腸道菌群中多糖消化酶、膽固醇氧化鎂等可降解膽固醇，降低血清TG和TC濃度。擬桿菌門(mén)與厚壁菌門(mén)同為腸道主要菌群之一，二者存在一種互相促進(jìn)的共生關(guān)系，可共同促進(jìn)宿主吸收或儲(chǔ)存能量，故消化道內(nèi)擬桿菌門(mén)與厚壁菌門(mén)對(duì)發(fā)酵多糖十分重要，二者比例也十分重要，擬桿菌門(mén)降低或者厚壁菌門(mén)增高均有助于促進(jìn)肥胖。血脂、腸道菌群和肥胖密切相關(guān)，高脂飼料可減少大鼠腸道黏蛋白，降低菌群多樣性，削弱腸道屏障能力，導(dǎo)致厚壁菌門(mén)等致病菌的侵襲風(fēng)險(xiǎn)增加，擬桿菌門(mén)等腸道屏障修復(fù)菌減少。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，低、高劑量組大鼠血清TG、TC和LDL-C水平較低，擬桿菌門(mén)比例較高、厚壁菌門(mén)比例較低，提示膳食膽酸可調(diào)節(jié)大鼠血脂代謝，增加有益菌比例，減少致病菌比例，調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)腸道屏障能力。營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠因腸道菌群變化，腸道屏障修復(fù)菌比例降低，致病菌感染概率升高，誘發(fā)慢性炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為腸道炎癥。TNF-α為炎癥反應(yīng)中始動(dòng)細(xì)胞因子，IL-6參與炎癥急性期反應(yīng)，二者均為促炎細(xì)胞因子，結(jié)果顯示：低、高劑量組血清TNF-α和IL-6水平均低于模型組，提示膳食膽酸可減輕大鼠腸道炎癥。

研究[16]發(fā)現(xiàn)，膽酸可作為一種信號(hào)分子激活不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，發(fā)揮控制肥胖的作用。G蛋白偶聯(lián)受體是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)的重要調(diào)節(jié)器，調(diào)控機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖等多方面，有報(bào)道證明其可通過(guò)調(diào)控DNA合成影響促有絲分裂信號(hào)，從而影響脂肪細(xì)胞凋亡[17]。TGR5為一種G蛋白偶聯(lián)受體，是膽酸受體家族的重要成員之一，可與膽酸結(jié)合，引起下游一系列生物學(xué)效應(yīng)，從而調(diào)節(jié)機(jī)體能量平衡、新產(chǎn)代謝等。Chaudhari等[18]表明，TGR5激活參與了減肥過(guò)程。Xiao等[19]報(bào)道TGR5激活后可抑制NF-κB通路，發(fā)揮抗炎作用。NF-κB可被TNF-α、IL-6等刺激因子激活，從而調(diào)節(jié)多種促炎細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。結(jié)果顯示：與模型組比較，低、高劑量組TGR5蛋白相對(duì)表達(dá)量較高、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量較低，提示膽酸可能通過(guò)激活TGR5蛋白、抑制NF-κB通路發(fā)揮作用。

綜上所述，膳食膽酸對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠有減肥作用，可調(diào)節(jié)腸道內(nèi)擬桿菌門(mén)與厚壁菌門(mén)比例，發(fā)揮抗炎作用，可能是通過(guò)激活TGR5蛋白、抑制NF-κB通路實(shí)現(xiàn)的。