黃慧珍 王松松 林 凡,2 李曉冉 蘇陳穎 林曉暉,2 張捷平,2

(1 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,福州,350122; 2 中西醫(yī)結(jié)合慢性病研究福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福州,350122)

糖尿病是一種嚴(yán)重的慢性代謝性疾病,其中約90%為2型糖尿病(Diabetes Mellitus Type 2,T2DM)[1]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為T2DM早期發(fā)病機(jī)制是陰虛燥熱[2],將糖尿病歸屬于中醫(yī)消渴證范疇[3]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中記載,石斛具有補(bǔ)五臟虛勞羸瘦、益胃生津、滋陰清熱的功效,是治療“消渴證”的要藥[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明,石斛具有調(diào)節(jié)脂類代謝,改善胰島素抵抗和糖耐量,抑制炎癥反應(yīng),促進(jìn)葡萄糖依賴性促胰島素釋放肽(Glucose-dependent Insulinotropic Peptide,GIP-1)等降血糖激素分泌的作用[4]。但是石斛治療T2DM具體機(jī)制尚不明確,影響其進(jìn)一步開發(fā)與利用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的系統(tǒng)性和協(xié)同性與中醫(yī)整體觀念具有共同之處,將“一靶一藥”轉(zhuǎn)變?yōu)椤熬W(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)、多成分”,被廣泛用于探索中藥治療疾病的分子藥理學(xué)機(jī)制[5-8]。本研究通過分析石斛的活性成分及其靶點(diǎn),應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討石斛治療T2DM的分子機(jī)制,為其進(jìn)一步深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件 選取中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP,http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php),有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(PubChem,https:/pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/),BioMart數(shù)據(jù)庫(http://www.biomart.org/),人類蛋白質(zhì)參考數(shù)據(jù)庫(Human Protein Reference Database，HPRD),瑞士靶預(yù)測數(shù)據(jù)庫(Swiss Target Prediction，http://swisstargetprediction.ch/),人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards,https://www.genecards.org/),OmicShare網(wǎng)站(http://www.omicshare.com/),網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治鲕浖﨏ytoscape(3.8.0),Pubmed數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

1.2 石斛活性成分及其靶點(diǎn)、T2DM基因的獲取 通過Pubmed數(shù)據(jù)庫進(jìn)行文獻(xiàn)挖掘,以“石斛”“化合物”等為關(guān)鍵詞,獲取已知的石斛成分,并利用TCMSP,根據(jù)口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)>20%篩選出可能的活性成分。隨后采用化學(xué)相似性的方法,通過檢索Swiss Target Prediction、PubChem數(shù)據(jù)庫,獲取石斛活性成分的靶點(diǎn)(P≥0.8)。從GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索收集T2DM的疾病基因。

1.3 石斛活性成分-靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將石斛活性成分及其對應(yīng)的靶蛋白導(dǎo)入Cytoscape(3.8.0),構(gòu)建“石斛活性成分-靶蛋白”網(wǎng)絡(luò),并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析,評價石斛各活性成分與靶蛋白的關(guān)聯(lián)度。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 通過HPRD數(shù)據(jù)庫獲取人類PPI數(shù)據(jù),導(dǎo)入Cytoscape(3.8.0)作為背景網(wǎng)絡(luò);利用1.2所得石斛活性成分靶點(diǎn)和T2DM基因分別構(gòu)建“石斛活性成分靶點(diǎn)-人類蛋白”PPI網(wǎng)絡(luò)、“T2DM疾病基因-人類蛋白”PPI網(wǎng)絡(luò);將上述2個PPI網(wǎng)絡(luò)映射獲得“石斛靶蛋白-T2DM相關(guān)蛋白”PPI網(wǎng)絡(luò),并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析,預(yù)測石斛治療T2DM的分子機(jī)制。以節(jié)點(diǎn)的自由度值代表與該節(jié)點(diǎn)相連邊的條數(shù),以中介中心性描述該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的作用和影響程度。這2個參數(shù)值越大,說明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的作用越重要,以提示其所代表蛋白在石斛治療T2DM中的作用大小。

1.5 基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析 將1.4分析所得石斛治療T2DM靶點(diǎn)導(dǎo)入BioMart數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換基因格式,通過Omishare平臺進(jìn)行GO富集分析與KEGG通路富集分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T2DM基因、石斛活性成分及其靶點(diǎn)的獲取和篩選 通過文獻(xiàn)檢索收集到石斛活性成分391種,主要包括生物堿類、黃酮類、酚類、萜類等,其中OB>20%的活性成分有15個。獲得57個活性成分潛在作用靶點(diǎn)(P≥0.8)(表1),其中木犀草素(Luteolin)和芹菜素(Apigenin)的靶蛋白數(shù)量分別為31個、27個。將石斛活性成分及其對應(yīng)的靶蛋白導(dǎo)入Cytoscape(3.8.0)進(jìn)行可視化分析,網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果也表明木犀草素和芹菜素是作用靶蛋白數(shù)量最多的活性成分(圖1),提示二者可能為石斛發(fā)揮作用的關(guān)鍵成分。通過檢索Gene Cards數(shù)據(jù)庫,獲取T2DM基因5 436個。分析表明,77%石斛活性成分靶蛋白為T2DM基因,提示石斛具有治療T2DM作用。

2.2 “石斛靶蛋白-T2DM相關(guān)蛋白”PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 分別構(gòu)建“T2DM疾病基因-人類蛋白”和“石斛活性成分靶蛋白-人類蛋白”PPI網(wǎng)絡(luò),映射獲得“石斛靶蛋白-T2DM疾病相關(guān)蛋白”PPI網(wǎng)絡(luò)。見圖2。根據(jù)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果,石斛活性成分可直接或間接作用于917個T2DM疾病相關(guān)蛋白(40個靶蛋白及877個靶蛋白相互蛋白),占“石斛活性成分靶蛋白-人類蛋白”PPI網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)的99%,再次提示石斛治療T2DM的作用。其中,自由度和中介中心性均為前10位的節(jié)點(diǎn)包括腫瘤蛋白P53(Tumor Protein P53,TP53)、E1A結(jié)合蛋白P300(E1A Binding Protein p300,EP300)、雌激素受體α(Estrogen Receptor Alpha,ESR1)、酪蛋白激酶2α(Casein KinaseⅡAlpha,CSNK2A1)等。見表2。這些節(jié)點(diǎn)屬于網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),是溝通其他節(jié)點(diǎn)的關(guān)鍵,可能在石斛治療T2DM中發(fā)揮重要作用。

2.3 GO與KEGG通路富集結(jié)果與分析 KEGG分析結(jié)果獲得162條信號通路(P<0.01),將前30條通路轉(zhuǎn)化為柱狀圖。見圖3。主要有AGE-RAGE通路、PI3K-AKT通路、叉頭框O(Forkhead Box O,FOXO)通路等。自由度和中介中心性均為前10位的節(jié)點(diǎn)中,TP53、蛋白激酶C-α(Protein Kinase C alpha,PRKCA)富集在PI3K/AKT通路;EP300、SMAD家族成員3(SMAD Family Member 3,SMAD3)、SMAD家族成員2(SMAD Family Member 2,SMAD2)富集在FOXO通路;SMAD3、SMAD2、PRKCA同時富集在晚期糖基化終末產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(Advanced Glycosylation End Products-Receptor of AGEs,AGEs-RAGE)通路;SRC原癌基因、非受體酪氨酸激酶也可能通過AGEs-RAGE信號通路,在T2DM的病情進(jìn)展中發(fā)揮作用[8]。已知,PI3K/AKT、FOXO以及AGEs-RAGE信號通路可通過氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗參與T2DM及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。石斛可能通過關(guān)鍵預(yù)測靶蛋白調(diào)節(jié)上述信號通路在T2DM中發(fā)揮作用。

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)分析石斛在治療T2DM中的靶向作用,對其相關(guān)的分子機(jī)制進(jìn)行探討。通過化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖分析,關(guān)鍵化合物為黃酮類化合物木樨草素,其次是芹菜素,分別對應(yīng)靶基因31個、27個。木犀草素和芹菜素是具有抗糖尿病作用的氧化型黃酮中藥單體成分。木犀草素和芹菜素均能通過與自由基反應(yīng),提高機(jī)體抗氧化能力,緩解糖尿病大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng),減輕胰島細(xì)胞的氧化損傷[9-10]。其中,木犀草素通過抑制p38通路與核因子κB的激活,減少炎癥介質(zhì)和氧化應(yīng)激指標(biāo)的表達(dá),發(fā)揮對胰腺組織、腦組織、糖尿病心肌病的保護(hù)作用[11];芹菜素能顯著改善糖尿病大鼠血糖、血脂水平,抑制肝組織形態(tài)學(xué)改變和脂肪變性[10,12]。

通過“石斛靶蛋白-T2DM疾病基因”PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?石斛可能通過40個靶蛋白及877個靶蛋白相互蛋白對T2DM起治療作用,TP53、EP300、SRC、ESR1、SMAD3、PRKCA、CSNK2A1、SMAD2為網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶蛋白。其中,TP53、ESR1、CSNK2A1參與對胰島素的調(diào)節(jié)過程,TP53激活,促進(jìn)胰島細(xì)胞的衰老,導(dǎo)致胰島素抵抗[13];ESR1可增強(qiáng)胰島素敏感性,改善糖、脂代謝紊亂,當(dāng)表達(dá)缺陷時可導(dǎo)致胰島素抵抗[14-15];CSNK2A1可促進(jìn)胰島素分泌[16];SMAD3、SMAD2可促進(jìn)糖尿病鼠纖維化相關(guān)基因表達(dá),導(dǎo)致肝臟纖維化[17]。

提取重復(fù)節(jié)點(diǎn)并導(dǎo)入OmicShare網(wǎng)站進(jìn)行GO和KEGG通路分析,GO富集結(jié)果(P<0.05)顯示,重復(fù)節(jié)點(diǎn)主要富集于酶結(jié)合、蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等分子功能,以及細(xì)胞過程正調(diào)控、代謝過程正調(diào)控和對內(nèi)源性刺激的應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)過程,其中代謝紊亂、氧化應(yīng)激以及對炎癥介質(zhì)應(yīng)答能力下降會導(dǎo)致T2DM及其并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展[7]。

通過KEGG信號通路分析,AGEs-RAGE相互作用啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián),引起氧化應(yīng)激,促進(jìn)T2DM及其血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。機(jī)體內(nèi)活性氧的生成增多和清除力下降被稱為氧化應(yīng)激,活性氧在體內(nèi)蓄積引起機(jī)體氧化損傷[19]。AGEs和RAGE結(jié)合后,激活PI3K/AKT通路,PI3K/AKT通路激活還原型輔酶Ⅱ氧化酶,促進(jìn)活性氧的生成,使氧化應(yīng)激作用增強(qiáng)導(dǎo)致組織損傷[10],同時進(jìn)一步激活MAPK等介導(dǎo)的信號通路,使核因子κB活化[18],反饋性刺激RAGE以及炎癥介質(zhì)、內(nèi)皮素、黏附因子、促凝血組織因子等基因的表達(dá),使血流調(diào)節(jié)受損[19],同時觸發(fā)瀑布式炎癥反應(yīng),引起細(xì)胞損傷和功能紊亂。隨著RAGE表達(dá)增加,糖尿病鼠內(nèi)皮細(xì)胞顯著減少,細(xì)胞凋亡和粥樣斑塊的炎癥反應(yīng)增加,促進(jìn)免疫細(xì)胞聚集在炎癥部位[20-21],最終促進(jìn)T2DM的發(fā)展及其血管并發(fā)癥的發(fā)生,如微血管并發(fā)癥糖尿病腎病、神經(jīng)病變、視網(wǎng)膜病變;大血管并發(fā)癥動脈粥樣硬化等。

AGEs-RAGE信號通路還可通過激活FOXO相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子等機(jī)制導(dǎo)致胰島素抵抗。胰島素抵抗是T2DM的發(fā)病基礎(chǔ),可導(dǎo)致胰島素維持血糖穩(wěn)態(tài)的能力下降[22]。FOXO蛋白可促進(jìn)脂質(zhì)代謝,其中FOXO1和FOXO3參與了肝臟葡萄糖代謝和脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)。FOXO1可促進(jìn)脂肪細(xì)胞中脂肪三酰甘油脂肪酶(Adipose Triglyceride Lipase,ATGL)的表達(dá),并以ATGL依賴的方式促進(jìn)肝細(xì)胞中脂肪酸氧化(Fatty Acid Oxidation，F(xiàn)AO);此外,FOXO蛋白可作為胰島素作用的直接靶點(diǎn)。在PI3K/AKT信號通路中,胰島素水平和蛋白激酶B活性增加,可以促進(jìn)肝臟中FOXO蛋白磷酸化增加,使FOXO蛋白功能降低,導(dǎo)致胰島素抵抗[23-24]。

本研究發(fā)現(xiàn),關(guān)鍵靶蛋白TP53、PRKCA富集在PI3K/AKT通路;EP300、SMAD3、SMAD2富集在FOXO通路;SMAD3、SMAD2、PRKCA同時富集在AGEs-RAGE通路,提示石斛可能通過富集在AGE-RAGE、PI3K-AKT、FOXO信號通路上的關(guān)鍵靶蛋白在T2DM的治療中發(fā)揮作用。與上述結(jié)果相一致的是,一些研究也表明石斛多糖和石斛酚可以抑制PI3K/AKT信號通路和AGEs-RAGE信號通路,減弱該通路介導(dǎo)的核因子κB激活、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)效應(yīng)[25-27]。

綜上所述,石斛可能主要通過木樨草素、芹菜素影響TP53、EP300、SRC等關(guān)鍵預(yù)測靶蛋白的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控AGE-RAGE、PI3K-AKT、FOXO等信號通路,抵抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗,調(diào)節(jié)糖脂代謝,從而在治療T2DM中發(fā)揮作用。這為應(yīng)用石斛治療T2DM提供了一定理論依據(jù),為進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。