周婷，田曉菊*，周桂珍，徐佳敏，王志新

1(寧夏大學(xué) 食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川，750021)2(寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川，750021)3(寧夏昊王米業(yè)集團(tuán)有限公司，寧夏 銀川，751400)

枸杞(Lyciumbarbarum)為茄目(Solanales)茄科(Solanaceae)枸杞屬(Lycium)多年生落葉灌木[1]，在我國是重要的藥食兩用資源。相關(guān)研究表明，枸杞的功能特性歸功于其高含量的營養(yǎng)素(維生素、礦物質(zhì)、葉酸和纖維素等)和酚類物質(zhì)。其中，多酚類物質(zhì)是植物界中最常見的含量豐富的芳香族次生代謝產(chǎn)物，被稱為人體的“第七類營養(yǎng)素”，人體不能通過自身合成，需從外界食物中獲取[2]，多酚類物質(zhì)作用于人體的生理功能主要包括抗氧化[3]、抗炎[4]、抗癌[5]、降血脂[6]、降血糖[7]等。

由于品種、加工條件、貯存方式等方面的制約，植物的酚類物質(zhì)活性容易發(fā)生相應(yīng)的變化。近年來，隨著各類代謝組學(xué)方法日趨成熟，依賴代謝組學(xué)手段對植物中酚類物質(zhì)的檢測、鑒定與分析能夠幫助人們建立食品功能活性變化與代謝物之間的關(guān)系[8]。例如，WANG等[9]以液相色譜-電噴霧質(zhì)譜(liquid chromatography-electrospray mass spectrometry, LC-ESI-MS/MS)為檢測手段，利用廣泛靶向代謝組分析了5個柑橘品種中169個類黃酮的代謝產(chǎn)物；ZHAO等[10]采用超高效液相色譜-光電二極管陣列質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-diode array detector mass spectrometry, UPLC-DAD-MS)，探索了微波處理、烘烤及煮沸對藍(lán)莓中酚類物質(zhì)的影響；雷嗣超等[11]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry, UPLC-MS/MS)，利用廣泛靶向代謝技術(shù)研究了板栗皮中兒茶素類物質(zhì)經(jīng)過模擬消化體系后的組成變化，得出其在消化過程中穩(wěn)定性較差。上述研究說明了代謝組學(xué)技術(shù)在植物多酚成分科學(xué)研究中的可靠性以及廣闊的前景。

但是，利用代謝組學(xué)技術(shù)對枸杞酒發(fā)酵前后酚類物質(zhì)變化的研究卻鮮有報道。本研究以寧杞1號枸杞干果為研究材料，采用超高效液相色譜-離子阱-靜電場軌道阱質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-linear ion trap quadrupole-Orbitrap-mass-spectrometry，UPLC-LTQ-Orbitrap-MS)，利用廣泛靶向代謝技術(shù)，對枸杞酒發(fā)酵前后酚類物質(zhì)的主要代謝成分及酚類物質(zhì)的積累做了分析，拓寬了對枸杞及枸杞酒中多酚類成分的基礎(chǔ)研究，為枸杞酒活性機(jī)理的研究奠定理論基礎(chǔ)，并為枸杞的深加工利用提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

寧杞1號枸杞干果，中寧縣吉利寶枸杞制品有限公司；白砂糖，市售；一水檸檬酸(食品級)，濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司；果膠酶、Txl釀酒活性干酵母，法國LAMOTHE-ABIET公司；甲醇(純度≥99.9%)、甲酸(純度≥98.0%)、乙腈(純度≥99.9%)，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

LTQ Orbitrap XL Domain35A高分辨液-質(zhì)聯(lián)用儀，Thermo Fisher公司；超純水機(jī)，湖南科爾頓水務(wù)有限公司；靜音真空高速破壁機(jī)，九陽股份有限公司；數(shù)字折射計(jì)，浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司；PHSJ-3F實(shí)驗(yàn)室PH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；電子恒溫不銹鋼水浴鍋，上海宜昌儀器紗篩廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 枸杞酒釀造工藝

原料揀選→沖洗→復(fù)水→打漿→硫殺→酶解→過濾→調(diào)整成分→接種酵母→陳釀→灌裝→成品

枸杞汁制備：剔除枸杞中的霉果、爛果，流動水沖洗干凈表面的灰塵，瀝干水分后以1∶7(g∶mL)的料水比加入超純水浸泡6 h，打漿2 min，加入H2SO3使SO2的質(zhì)量濃度達(dá)到60 mg/L，添加40 mg/kg果膠酶，45 ℃恒溫水浴酶解5 h，1、2、4、8層紗布依次過濾，初始糖度為8.4 °Brix，白砂糖調(diào)節(jié)糖度至20.0 °Brix，一水檸檬酸調(diào)節(jié)pH至3.2～3.5。

接種酵母：配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%～5%的糖溶液，將干酵母以枸杞發(fā)酵汁總量0.2 g/L計(jì)算用量，加入配制好的糖溶液中，置于25～30 ℃培養(yǎng)箱中30 min后，加入制備好的枸杞汁中。

發(fā)酵：將枸杞汁裝入2.5 L發(fā)酵罐，置于20 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵，主發(fā)酵結(jié)束后吸取上清液進(jìn)行陳釀，15 ℃陳釀90 d。分別在發(fā)酵0 d(BF)以及陳釀90 d(AF)取樣，3個生物學(xué)重復(fù)分別命名為BF-1、BF-2、BF-3和AF-1、AF-2、AF-3，存放于-80 ℃冰箱中。

1.3.2 樣品信息

待測樣本為AF-1、AF-2、AF-2和BF-1、BF-2、BF-3。同時制備質(zhì)控(quality control, QC)樣本：將BF組及AF組進(jìn)行等量混合，用于平衡色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)，評價系統(tǒng)穩(wěn)定性[12]。本研究設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)的樣品進(jìn)行3個技術(shù)重復(fù)。

1.3.3 多酚的提取

根據(jù)焦陽[13]的方法略作改進(jìn)：取樣品于4 ℃解凍，冷凍干燥后低溫研磨，稱取1 g于15 mL的Eppendorf管中，在不斷通入N2的同時加入10 mL 70%(體積分?jǐn)?shù))的甲醇溶液。避光超聲波處理30 min，4 ℃、10 000 r/min離心20 min，將上層清液收集于棕色瓶中，上述操作再進(jìn)行2次重復(fù)，將3次提取液收集混合后，再過0.22 μm有機(jī)相濾膜，避光保存于-80 ℃冰箱待測。

1.3.4 色譜分離

色譜柱規(guī)格型號：AccucoreTMC18，150 mm×2.1 mm，2.6 μm；流動相：A：乙睛，B：0.1%甲酸-水，洗脫梯度:0～1 min，5%～5% A；1～4 min，5%～10% A；4～10 min，10%～14% A；10～16 min，14%～70% A；16～16.5 min，70%～95% A，16.5～18 min，95%～95% A；柱溫35 ℃；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣體積2 μL；分析時間20 min。

1.3.5 質(zhì)譜采集

采用電噴霧電離源，在正離子和負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)，鞘內(nèi)氣體流速40 arb，輔助氣體流速10 arb，正、負(fù)離子模式下輔助氣體噴射電壓分別為3.50和3.20 kV，噴射電流0.04 μA，毛細(xì)管溫度350 ℃，毛細(xì)管電壓-30 V，管透鏡-110 V，低碰撞能15 eV，高碰撞能60 eV，設(shè)置一級質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍100～1 000m/z，二級質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍50～1 000m/z。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

通過文獻(xiàn)檢索匯總與枸杞相關(guān)的酚類物質(zhì)化學(xué)成分，通過HumanMetabolome Database (HMDB)(http://www.hmdb.ca)，Metlin(http://metlin.scripps.edu)，massbank(http://www.massbank.jp/)，mzclound(https://www.mzcloud.org/)等數(shù)據(jù)庫中進(jìn)一步匹配注釋獲得各代謝物準(zhǔn)確的一級、二級離子信息，根據(jù)相關(guān)信息自建枸杞酚類物質(zhì)化學(xué)成分質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。代謝物的鑒定首先進(jìn)行一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)對比(Δppm<10)，然后根據(jù)MS/MS模式所得碎片離子在自建庫中進(jìn)行比對確認(rèn)。利用XcaliburTM4.0軟件設(shè)置儀器方法、編輯序列和色譜、質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理。利用Omicshare云平臺(https://www.omicshare.com/tools/)、微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)以及Metware Cloud平臺(https://cloud.metware.cn/)進(jìn)行差異代謝物的相關(guān)數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于UPLC-LTQ-Orbitrap-MS平臺鑒定枸杞及枸杞酒中酚類化合物

基于樣品處理方法及分析條件，對枸杞酒發(fā)酵前后樣品中的酚類物質(zhì)進(jìn)行分析。在正、負(fù)離子模式下從BF及AF中共檢出55種酚類物質(zhì)(圖1)。BF中檢出52種酚類物質(zhì)。按照酚類物質(zhì)的一級分類，有28種酚酸、15種黃酮、5種酚酰胺衍生物、3種香豆素以及1種芪類。從AF中檢出49種酚類物質(zhì),其中包括23種酚酸、16種黃酮、6種酚酰胺衍生物、3種香豆素以及1種芪類。BF與AF共同檢出的物質(zhì)有46種，相關(guān)內(nèi)容見電子版增強(qiáng)出版附件(http://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.030506)，其中有22種酚酸、15種黃酮、5種酚酰胺衍生物、3種香豆素以及1種芪類。BF中檢出而AF未檢出物質(zhì)有6種，皆為酚酸類物質(zhì)，分別是4-甲氧基肉桂酸、對香豆酸甲酯、6-O-咖啡酰-D-葡萄糖、酪醇、1-O-肉桂酰-β-D-葡萄糖、阿魏酰咖啡酰酒石酸；AF中檢出而BF未檢出物質(zhì)有3種，1種酚酰胺衍生物、1種黃酮、1種酚酸，分別為N-N-二(二羥基咖啡酰)亞精胺、3′,4,4′,5,7-五羥基黃烷、4-氨基水楊酸。

發(fā)酵前有5種酚酸類物質(zhì)為結(jié)合態(tài)酚酸，相關(guān)研究表明，在發(fā)酵體系中，隨著微生物的作用，產(chǎn)生的酶類可將結(jié)合態(tài)酚酸分解為游離態(tài)酚酸[14]，這5種結(jié)合態(tài)酚酸或?qū)⒎纸鉃槿夤鹚?、對香豆酸、咖啡酸、阿魏酸等游離態(tài)酚酸，從而提高枸杞酒中酚酸類物質(zhì)的抗氧化活性及生物利用度。

圖1 實(shí)驗(yàn)組樣品的酚類物質(zhì)韋恩圖Fig.1 Venn diagram of phenolic substances in different groups

2.2 酚類化合物主成分分析(principal components analysis,PCA)

PCA得分圖的聚散程度反映了樣本代謝物的相近程度，即反映了枸杞酒發(fā)酵前后酚類代謝物的聚集情況，在代謝水平上差異越大的樣品在得分圖上間距越大[15]。由圖2可知，QC樣本聚集性好，說明檢測過程儀器穩(wěn)定性好、信號較為穩(wěn)定，具有良好的實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性。實(shí)驗(yàn)組BF及AF在PCA空間緊密聚集，同時，第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的解釋率分別為99.16%和0.54%，兩者累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)99.70%，可見各實(shí)驗(yàn)組樣本之間分離效果較好，代謝物數(shù)據(jù)結(jié)果可靠，BF及AF組間存在顯著差異。BF與AF組分離明顯，這表明樣品經(jīng)過發(fā)酵處理后，樣品中的酚類代謝物發(fā)生了明顯的改變。

圖2 QC組和實(shí)驗(yàn)組樣品PCA得分圖Fig.2 PCA scoring plot of QC and experimental samples

2.3 酚類化合物正交偏最小二乘法分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)

OPLS-DA相對于偏最小二乘法分析，能夠有效剔除與研究無關(guān)的影響，從而篩選出差異代謝物，為準(zhǔn)確獲得組間及組內(nèi)酚類物質(zhì)的差異狀況，本研究又采用OPLS-DA有監(jiān)督的判別方法對發(fā)酵前后的酚類物質(zhì)進(jìn)行分析。OPLS-DA得分圖及置換檢驗(yàn)圖結(jié)果(圖3)與PCA結(jié)果大體一致，可以看出BF與AF組發(fā)生了明顯的分離。

a-模型得分圖；b-置換檢驗(yàn)圖圖3 實(shí)驗(yàn)組OPLS-DA得分圖及OPLS-DA置換檢驗(yàn)圖Fig.3 OPLS-DA model and OPLS-DA permutation test of different groups

2.4 酚類差異代謝物的篩選與分析

從共同可檢的46種酚類物質(zhì)中，依據(jù)T檢驗(yàn)，取P<0.05，差異倍數(shù)(fold change,FC)>2且FC<0.5，篩選出28種物質(zhì)，如圖4。再以O(shè)PLS-DA模型中變量的權(quán)重值(variable important in projection,VIP)>1為條件，篩選出的差異代謝物13種，如表1所示。

圖4 酚類差異代謝物火山圖Fig.4 Volcanic map of phenolic substances

由表1可見，在BF與AF組的對比中，篩選出差異代謝物共13種，其中包括酚酸、黃酮、酚酰胺衍生物以及香豆素，分別占比為57.14%、14.29%、14.29%以及7.14%。差異代謝物中，酚酸類物質(zhì)占比最大，且豐度高。篩選出的13種差異代謝物中，有5種物質(zhì)上調(diào)，分別是對香豆酸-4-O-葡萄糖苷、6-O-阿魏酰-D-葡萄糖、槲皮素-3-O-蕓香糖苷、N-N-二(二羥基咖啡酸)亞精胺己糖苷以及異莨菪亭。8種物質(zhì)下調(diào)，依次是1-萘酚、二氫阿魏酸、綠原酸、對香豆酸-4-O-二己糖苷、2,5-二羥基苯甲醛、α-羥基肉桂酸、苜蓿素-5-O-葡萄糖苷、(二氫咖啡酰)咖啡酰亞精胺。

表1 枸杞酒發(fā)酵前后酚類差異代謝物Table 1 Phenolic substances of L. barbarum wine before and after the fermentation

VIP>1.5的物質(zhì)，從大到小排序依次為6-O-阿魏酰-D-葡萄糖、N-N-二(二羥基咖啡酸)亞精胺己糖苷、異莨菪亭、二氫阿魏酸、(二氫咖啡酰)咖啡酰亞精胺、對香豆酸-4-O-二己糖苷。這6種物質(zhì)中，6-O-阿魏酰-D-葡萄糖對整個模型的貢獻(xiàn)率最大，其他物質(zhì)則依次遞減。

為了直觀觀察發(fā)酵前后酚類差異代謝物的濃度變化趨勢，依據(jù)每個差異代謝物的相對含量做出熱圖，如圖5所示，熱圖的顏色代表了代謝物在該組樣本中相對表達(dá)量的大小，顏色由綠到黃再到紅代表著代謝物豐度逐漸升高，高低表達(dá)交互存在，紅色為高表達(dá)組分，綠色為低表達(dá)組分。依據(jù)2組樣品進(jìn)行聚類，可將圖5分成2個區(qū)域，發(fā)酵前樣品為第一區(qū)域，發(fā)酵后的枸杞酒為第二區(qū)域。

酚酸具有良好的生物學(xué)活性，枸杞中酚酸類化合物，如咖啡酸和綠原酸，可抗病毒、抗腫瘤、抗氧化，阿魏酸有消炎、抗血栓的作用[16]；所篩選的差異代謝物中酚酸類物質(zhì)顯著上調(diào)的有對香豆酸-4-O-葡萄糖苷、6-O-阿魏酰-D-葡萄糖，顯著下調(diào)的有1-萘酚、二氫阿魏酸、綠原酸、對香豆酸-4-O-二己糖苷、2,5-二羥基苯甲醛、α-羥基肉桂酸。在枸杞酒發(fā)酵過程中酚酸類物質(zhì)大多呈下調(diào)趨勢，相關(guān)研究表明，一些酵母或細(xì)菌可將酚酸類物質(zhì)脫羧為乙烯基酚，導(dǎo)致酚酸類物質(zhì)含量下降[17]。其中，對香豆酸-4-O-二己糖苷下調(diào)的同時，對香豆酸-4-O-葡萄糖苷上調(diào)，推測其側(cè)鏈二糖基團(tuán)在發(fā)酵過程中分解為單糖基團(tuán)。

圖5 酚類差異代謝物聚類熱圖Fig.5 Cluster heat map of phenolic substances

黃酮類物質(zhì)也廣泛存在于自然界的漿果中，枸杞黃酮是眾多生理實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮抗氧化、抗衰老、治療心腦血管疾病等藥理活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，不僅可以抗輻射、抗疲勞、促進(jìn)免疫力，還能減緩細(xì)胞的退化，預(yù)防癌癥的發(fā)生[18-21]。所篩選的差異代謝物中酚酸類物質(zhì)呈顯著上調(diào)的是槲皮素-3-O-蕓香糖苷(蘆丁)。蘆丁是一種良好的抗氧化劑，其苷元槲皮素，與綠原酸、山奈酚、異鼠李素是枸杞果實(shí)中具有較高抗氧化活性的物質(zhì)[22]，枸杞酒中的蘆丁含量增加可能是由于枸杞果實(shí)中的前體物質(zhì)在發(fā)酵過程中合成。有研究表明，由于黃酮類物質(zhì)龐大的糖苷基團(tuán)，使得其位阻效應(yīng)起首要作用，削弱或阻礙了苯環(huán)3、4位的—OH的作用，使得其抗氧化性降低，但蘆丁的糖苷化卻對抗氧化性無顯著影響[23]，故枸杞酒發(fā)酵過程蘆丁含量增加，或?qū)⒃黾予坭骄频目寡趸钚?；苜蓿?5-O-葡萄糖苷則呈顯著下調(diào)，可能是酵母中的β-葡萄糖苷酶使葡萄糖苷部分水解導(dǎo)致。

枸杞中的酚酰胺衍生物除具有抗菌、抗病毒、抗癌等藥理作用外，還可通過激活Nrf2/HO-1途徑來預(yù)防腦I/R損傷，改善氧化損傷和神經(jīng)細(xì)胞凋亡[24]。在表1的代謝物中，N，N-二(二羥基咖啡酸)亞精胺己糖苷呈顯著上調(diào)，VIP值為2.39，大于呈下調(diào)的(二氫咖啡酰)咖啡酰亞精胺，表明其對模型的貢獻(xiàn)率較大。(二氫咖啡酰)咖啡酰亞精胺下調(diào)伴隨著N，N-二(二羥基咖啡酸)亞精胺己糖苷上調(diào)，推測二者是前體與產(chǎn)物的關(guān)系。另外，有研究報道，酚酰胺衍生物為枸杞果實(shí)中苦味物質(zhì)的重要來源[25-26]，或?qū)⑴c枸杞酒中苦味有關(guān)，這些都有待進(jìn)一步研究。

部分香豆素具有抗炎、鎮(zhèn)痛以及降低尿酸的作用，枸杞中抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性的主要物質(zhì)可能為香豆素類化合物[27-29]。實(shí)驗(yàn)檢測出的異莨菪亭顯著上調(diào)，或?qū)⒏迂S富枸杞酒的生理功能。

3 結(jié)論

本研究基于UPLC-LTQ-Orbitrap-MS技術(shù)，結(jié)合自建枸杞酚類物質(zhì)數(shù)據(jù)庫，鑒定出寧杞1號枸杞中含有酚酸、黃酮、酚酰胺衍生物、香豆素、芪類等5大類物質(zhì)中的55種酚類物質(zhì)，通過PCA和OPLS-DA，從代謝組學(xué)層面系統(tǒng)分析了寧杞1號枸杞在發(fā)酵前后酚類物質(zhì)的差異。共篩選出13種差異代謝物，通過顯著變化的酚類物質(zhì)分析表明，枸杞發(fā)酵過程中，酚類物質(zhì)的各類變化將賦予枸杞酒更顯著的生理活性及風(fēng)味特征，研究結(jié)果為探索酒精發(fā)酵對酚類物質(zhì)的影響及代謝機(jī)制提供參考。