王純瑋，白英

(內蒙古農業(yè)大學 食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特，010018)

開菲爾(Kefir)起源于俄羅斯北高加索地區(qū)，是一種酸性、黏性、低酒精含量的乳制品飲料，被稱為“發(fā)酵牛奶中的香檳”和“奇怪的”發(fā)酵牛奶[1]。開菲爾是由開菲爾粒(Kefir grains)發(fā)酵而成的，開菲爾粒是含有乳酸菌、醋酸菌和酵母菌的復雜微生物共生混合物，為直徑1～15 mm的凝膠狀淺黃色或白色顆粒[2]。發(fā)酵過程中，酵母菌可產生少量的CO2，使開菲爾在普通酸奶產品中的味道和風味顯著不同。

開菲爾胞外多糖(Kefiran)含有大約等量的D-葡萄糖和D-半乳糖，是一種黏合劑，起到固定微生物的作用，與各種微生物形成了開菲爾粒結構的骨架[3]，并保護開菲爾粒免受外部微生物的危害。其還具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、減少血清膽固醇水平和調節(jié)腸道免疫系統(tǒng)[4]等功能特性。開菲爾胞外多糖作為一種具有生物活性的新型多糖，引起了食品研究人員的廣泛關注，目前其已應用于食品和制藥行業(yè)[5]。

目前有關開菲爾胞外多糖的報道主要是從開菲爾粒中提取并進行研究，而鮮少有對開菲爾發(fā)酵乳中的多糖進行研究。故本實驗分別對開菲爾粒中胞外多糖(Kefiran-G)和開菲爾發(fā)酵乳中胞外多糖(Kefiran)進行提取，并對提取條件進行優(yōu)化。對比分析了2種多糖的結構、絮凝活性、乳化性和抗氧化活性，為開菲爾胞外多糖的進一步開發(fā)利用提供必要的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

開菲爾粒，錫林郭勒盟牧民家庭；脫脂乳粉，丹麥Arla Foods乳品公司；抗壞血酸，深圳樂芙生物科技有限公司；2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), ABTS]，上海翌圣生物科技有限公司；正十六烷、溴化鉀(光譜純)，上海麥克林生化科技有限公司；其他所用試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

T6-新世紀紫外-可見分光光度儀，北京普析通用儀器有限責任公司；HC-2T18R型冷凍高速離心機，日本Hitachi公司；DW-86L338A型凍干機(-80 ℃)，青島海爾特種電器有限公司；TM4000掃描電鏡，日本株式會社日立高新技術那珂事業(yè)所；IRAffinity-1傅里葉變換紅外光譜儀，日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養(yǎng)條件

開菲爾粒用無菌生理鹽水沖洗后以5%的接種量接種于無菌冷卻的脫脂乳培養(yǎng)基中，并取在28 ℃下連續(xù)培養(yǎng)至pH穩(wěn)定后的開菲爾粒及開菲爾發(fā)酵液為實驗原料。

1.3.2 培養(yǎng)基的配制

脫脂乳培養(yǎng)基：將脫脂乳粉與蒸餾水以料液比1∶10(g∶mL)制成脫脂乳培養(yǎng)基，110 ℃滅菌10 min。

1.3.3 開菲爾發(fā)酵乳中Kefiran的提取工藝

單因素試驗：向上清液中加入95%乙醇，體積分別為上清液體積的1、2、3、4、5倍；乙醇體積分數(shù)分別為75%、80%、85%、90%、95%、100%和醇沉時間為6、12、18、24、30、36、42 h的條件下進行提取。

正交試驗：在單因素試驗的基礎上，以提取率為指標，乙醇體積、乙醇體積分數(shù)和醇沉時間為3個因素進行L9(33)正交試驗。提取率按公式(1)計算：

(1)

式中：ρ，從標準曲線中計算出提取液中多糖的量，mg/mL；m，同體積發(fā)酵液凍干后的質量，g；V，Kefiran提取液總體積，mL。

開菲爾發(fā)酵乳中Kefiran的提取工藝如下：

發(fā)酵液取上清液10 mL→旋轉蒸發(fā)→乙醇沉淀(4 ℃)→離心(10 000 r/min，30 min)→沉淀復溶→sevag法除蛋白質→旋蒸除有機溶劑→透析12 h(4 ℃)→冷凍干燥

1.3.4 開菲爾粒中Kefiran-G的提取工藝

單因素試驗：料液比為1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80(g∶mL)，提取溫度為60、70、80、90、100 ℃和提取時間為15、30、60、120、240 min的條件下進行提取。開菲爾粒中Kefiran-G的提取工藝如下：

取開菲爾粒1 g→水浴加熱→離心(9 200 r/min，15 min，4 ℃)→加入預冷無水乙醇，醇沉24 h(-20 ℃)→離心(10 000 r/min，20 min，4 ℃)→沉淀復溶→sevag法除蛋白質→旋蒸除有機溶劑→透析12 h(4 ℃)→冷凍干燥

正交試驗：在單因素試驗的基礎上，以提取率為指標，料液比、提取溫度和提取時間為3個因素進行L9(33)正交試驗。提取率計算如公式(2)所示：

(2)

式中：ρ，從標準曲線中計算出提取液中多糖的量，mg/mL；m，開菲爾粒的質量，g；V，Kefiran-G提取液總體積，mL。

1.3.5 結構測定

1.3.5.1 微觀結構測定

將樣品用導電雙面膠帶固定在樣品臺上，吹掉多余的粉末，用掃描電鏡觀察胞外多糖的表面結構。

1.3.5.2 紅外光譜測定

將樣品與溴化鉀按1∶100(質量比)的比例研磨使其混合均勻，壓片成薄片。于4 000～400 cm-1下掃描，掃描64次，分辨率為4 cm-1。

1.3.6 理化性質測定

1.3.6.1 乳化性測定

參照WANG等[6]的方法，取0.5 mg凍干Kefiran、Kefiran-G、黃原膠和瓜爾豆膠，分別溶于0.5 mL去離子水中，水浴煮沸20 min，冷卻至室溫后加入磷酸鹽緩沖溶液調節(jié)至2 mL，加入0.5 mL十六烷，渦旋10 min后立即在波長540 nm處讀取溶液的吸光度，記為A0。每個溶液樣品按順序室溫孵育30、60和90 min，并記錄在540 nm處的吸光度At。樣品的乳化能力計算如公式(3)所示：

(3)

式中：A0，0 min時的吸光度；At，分別在30、60和90 min時的吸光度。

1.3.6.2 絮凝活性測定

參照HAN等[7]的方法并略有修改。取2 g/L高嶺土懸浮液100 mL和1 mL質量分數(shù)1%CaCl2混合，在混合液中加入2 mL不同質量濃度(0.4～0.9 mg/mL)的Kefiran、Kefiran-G、黃原膠和瓜爾豆膠，渦旋振蕩3 min后于室溫下靜置10 min，測量在550 nm處的吸光度。絮凝活性計算如公式(4)所示：

(4)

式中：A，樣品懸浮液吸光度；A0，空白對照組吸光度。

1.3.7 抗氧化特性測定·OH清除能力參照文獻[8]的方法；總還原力的測定參照文獻[9]的方法；ABTS陽離子自由基清除能力的測定參照文獻[10]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

用Excel 2010、Origin 2019b和SPSS 26進行作圖與數(shù)據(jù)分析。實驗結果均以平均值±標準差表示，采用單因素方差分析法進行顯著性差異分析，當P<0.05時，表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)時間對開菲爾發(fā)酵乳pH和Kefiran產量的影響

由圖1可知，隨發(fā)酵時間的延長，開菲爾發(fā)酵乳的pH值和Kefiran產量出現(xiàn)明顯的變化。脫脂乳培養(yǎng)基的初始pH值為6.58，接種開菲爾粒后，pH值在發(fā)酵過程中呈下降趨勢，在0～36 h內pH值下降較快，40～84 h下降速度減緩，84 h后pH值達到3.6，基本趨于平穩(wěn)。

圖1 開菲爾發(fā)酵過程中pH 值和Kefiran含量的變化Fig.1 Changes of pH value and Kefiran content during Kefir fermentation

此外，在發(fā)酵過程中Kefiran含量在0.5～0.7 mg/mL波動。Kefiran的含量在發(fā)酵初期略有減少，可能是由于微生物生長過程需要消耗糖類物質。從第12 h開始Kefiran含量開始增加，微生物在生長過程中為避免酸類物質對其的抑制作用，會產生更多Kefiran以保護自身。Kefiran含量在72 h后下降，可能是由于多糖水解酶將其水解所致[11]。開菲爾發(fā)酵72 h時，pH值為3.65，并且此時Kefiran的含量最大，故將發(fā)酵72 h判定為發(fā)酵終點，在此時進行Kefiran的提取。

2.2 Kefiran提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗

以乙醇體積分數(shù)、醇沉時間、乙醇體積作為影響因素，以Kefiran提取率作為衡量指標進行單因素實驗對Kefiran進行提取，3個因素均對Kefiran的提取率有顯著影響(P<0.05)。最終確定Kefiran最優(yōu)單因素提取工藝為乙醇體積分數(shù)為95%，醇沉24 h，乙醇體積為2倍。此條件下得到的Kefiran提取率達到最高值分別為(2.25±0.33)%，(2.25±0.22)%，(2.79±0.19)%。單因素結果如圖2所示。

a-乙醇體積分數(shù)；b-醇沉時間；c-乙醇體積圖2 乙醇體積分數(shù)、醇沉時間、乙醇體積對Kefiran提取率的影響Fig.2 Effects of ethanol concentration, ethanol precipitation time and ethanol volume on the extraction yield of Kefiran注：不同小寫字母表示同一樣品不同濃度間具有顯著差異(P<0.05)

2.2.2 正交試驗

提取Kefiran的正交設計因素水平表及正交試驗結果分別見表1與表2。由表可知，3個因素的主次順序為A>C>B。從9組處理中找出最優(yōu)水平組合為第9組，即A3B3C2，且提取率達到4.38%，而正交優(yōu)化最佳水平組合為A3B2C3，提取率達(4.05±0.08)%。

表1 L9(33)正交設計因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal test

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experiment

經過驗證，第9組處理的提取率優(yōu)于正交優(yōu)化水平組合，得到最佳工藝條件為：乙醇體積3倍、乙醇體積分數(shù)95%、醇沉時間36 h。

2.3 Kefiran-G提取工藝的優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗

以料液比、提取時間和提取溫度作為影響因素，以Kefiran-G提取率作為衡量指標進行單因素實驗對Kefiran-G進行提取，3個因素均對Kefiran-G的提取率有顯著影響(P<0.05)。最終確定的Kefiran-G最優(yōu)單因素提取工藝為料液比1∶10，提取時間60 min，提取溫度90 ℃。此條件下得到的Kefiran-G提取率達到最高值分別為(8.71±0.42)%，(5.14±0.29)%，(6.71±0.58)%。單因素結果如圖3所示。

a-料液比；b-提取時間；c-提取溫度圖3 料液比、提取時間、提取溫度對Kefiran-G提取率的影響Fig.3 Effects of solid-liquid radio, extraction time and extraction temperature on the extraction yield of Kefiran-G

2.3.2 正交試驗

提取Kefiran-G的正交設計因素水平表及正交試驗結果分別見表3與表4。

表3 L9(33)正交設計因素水平表Table 3 Factors and levels table of orthogonal test

表4 正交試驗結果Table 4 Results of orthogonal experiment

由表4可知，3個因素的主次關系為C>B>A。正交實驗結果表明，各因素不同水平的最佳配比為A1B3C3。即提取時間120 min、提取溫度100 ℃、料液比1∶5(g∶mL)，提取率為(5.10± 0.38)%。此條件下得到的Kefiran-G提取率最高。

2.4 紅外光譜分析

圖4 Kefiran和Kefiran-G的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectra of Kefiran and Kefiran-G

2.5 掃描電子顯微鏡

Kefiran和Kefiran-G的三維微觀結構存在明顯差異(圖5)，發(fā)酵乳中Kefiran表面光滑具有薄膜特點，結構疏松，間或呈網(wǎng)狀結構；開菲爾粒中Kefiran-G的表面結構緊致光滑，也具有薄膜特點且邊緣為不規(guī)則的枝狀結構。有研究表明，緊致光滑的表面結構和枝狀結構對于改善各種食品的流變特性至關重要[18]。而Kefiran-G的枝狀結構末端有許多大小形狀相似的球形結構黏附其上，發(fā)現(xiàn)其外觀神似于神經元突觸，猜想其具有捕獲菌種、蛋白質及其他物質的能力，進而形成開菲爾粒，后期可由此對開菲爾粒的成粒機制做進一步研究。

a-Kefiran；b-Kefiran-G圖5 Kefiran和Kefiran-G的微觀結構Fig.5 Microstructure of Kefiran and Kefiran-G

2.6 乳化性分析

據(jù)MANNINA等[19]的研究可知，微生物多糖和植物膠具有乳化作用，如瓜爾豆膠和黃原膠等，特別是微生物源的黃原膠，因其具有較高的乳化活性而在食品工業(yè)中得到了廣泛的應用。多糖的乳化能力可以用多糖在溶液中保持乳狀液狀態(tài)的時間長短評判。本文將Kefiran、Kefiran-G與黃原膠、瓜爾豆膠商品多糖進行了比較。結果表明(表5)，Kefiran在30和60 min時的乳化保留率分別為56.42%和51.68%。Kefiran-G在30和60 min時的乳化保留率分別為57.17%和48.26%。瓜爾豆膠的乳化保留率分別為41.66%和30.31%，黃原膠乳化保留率分別為46.52%和40.11%。Kefiran和Kefiran-G的乳化活性高于瓜爾豆膠，略高于黃原膠。由于Kefiran和Kefiran-G是由具有公認為安全(Generally Recognized As Safe，GRAS)分類的菌株產生的，因此，Kefiran和Kefiran-G可作為乳化劑應用于食品行業(yè)，而Kefiran的乳化活性在30～60 min內僅下降4.74%，說明Kefiran在溶液中保持乳狀液狀態(tài)的時間較長，因此具有比Kefiran-G更好的乳化穩(wěn)定性。

表5 Kefiran的乳化活性Table 5 Emulsifying activity of Kefiran

2.7 絮凝分析

生物絮凝劑是微生物生長過程中產生的，是安全、可生物降解的。WANG等[3]從新疆開菲爾粒中分離到1株產胞外多糖的腸膜明串珠菌XR1，其胞外多糖與黃原膠和瓜爾豆膠相比具有良好的絮凝性能。所以選取黃原膠和瓜爾豆膠為對照，比較不同來源開菲爾胞外多糖的絮凝活性。圖6顯示，4種樣品的絮凝活性均呈現(xiàn)出相同的變化趨勢，即絮凝活性隨著多糖濃度的增加而增加，到達最高凈化點后開始下降。這可能是由于只有絮凝劑周圍的顆粒才能參與絮凝反應，因此過量的絮凝劑被吸附而導致顆粒不穩(wěn)定[7]。本研究確定了Kefiran、Kefiran-G、黃原膠和瓜爾豆膠的最佳絮凝質量濃度分別為0.6、0.7、0.5、0.6 mg/mL。其中Kefiran-G在質量濃度0.4～0.9 mg/mL絮凝活性均較高，Kefiran-G的絮凝活性高于瓜爾豆膠和黃原膠，但Kefiran的絮凝活性低于瓜爾豆膠和黃原膠。Kefiran-G的絮凝活性顯著高于Kefiran，其原因可能是由于兩者的微觀結構不同，從圖5可看到，與Kefiran的相比，Kefiran-G的枝狀末端突起較明顯，增大了與其他物質接觸的表面積，有利于其吸附大分子物質，進而具有較好的絮凝性能。由于Kefiran-G有很高的絮凝活性且表面帶有很多活性基團，其結構中豐富的羥基、羧基、糖苷鍵等活性基團又可以提供大量的吸附位[20]。LIN等[21]研究了膳食纖維的吸附作用，因其分子表面帶有很多活性基團，可吸附螯合膽固醇、膽汁酸以及腸道內的有毒物質(內源性毒素)、化學藥品和有毒醫(yī)藥品(外源性毒素)等有機化合物。由此可推斷Kefiran-G可能也具有這些功能，后續(xù)可對此進行研究。

圖6 Kefiran、Kefiran-G、黃原膠和瓜爾豆膠的絮凝活性Fig.6 Flocculating capacity of Kefiran, Kefiran-G,xanthan gum and guar gum

2.8 抗氧化活性

由圖7可知，3種抗氧化能力均隨Kefiran和Kefiran-G濃度的增加而增加，但Kefiran和Kefiran-G的抗氧化能力有所不同。

在多糖質量濃度為1～9 mg/mL時，Kefiran的·OH清除能力高于Kefiran-G，當質量濃度達7 mg/mL時，Kefiran的·OH清除能力顯著高于Kefiran-G(P<0.05)，但均低于抗壞血酸。當質量濃度達9 mg/mL時，Kefiran與Kefiran-G的·OH清除率分別為(48.81±1.75)%和(23.38±1.43)%。多糖中的羧基能夠絡合金屬離子如Fe2+等，從而抑制生成·OH，而多糖中的羥基和羧基又可作為氫供體，提供氫原子與·OH反應從而清除·OH。

總還原力是評價樣品抗氧化活性的重要指標，還原能力測定通過鐵氰化鉀還原方法測量抗氧化劑的給電子能力[22]。在質量濃度5～40 mg/mL，Kefiran的總還原力高于Kefiran-G，在質量濃度為40 mg/mL時，兩者的總還原力分別達到(0.15±0.02)和(0.12±0.01)(圖7-b)。

ABTS陽離子自由基是帶正電荷的自由基，其清除主要原理是電子的轉移[23]。當多糖的質量濃度為1～9 mg/mL，Kefiran的ABTS陽離子自由基清除率高于Kefiran-G。當質量濃度在3～5 mg/mL時，Kefiran的ABTS陽離子自由基清除率高于抗壞血酸。當質量濃度為9 mg/mL時，Kefiran與Kefiran-G的ABTS陽離子自由基清除率分別為(81.44±0.80)%和(38.34±2.53)%。

a-·OH清除活性；b-總還原力；c-ABTS陽離子自由基清除活性圖7 不同來源開菲爾胞外多糖對·OH清除活性、總還原力、ABTS陽離子自由基清除活性的影響Fig.7 Effects of different sources on the hydroxyl radical scavenging activity, reducing power,ABTS radical scavenging activity of Kefiran注：小寫字母表示不同組間同一樣品之間的顯著性差異(P<0.05)；大寫字母表示不同樣品同一組內的顯著性差異(P<0.05)

結合所有抗氧化結果可知，Kefiran的抗氧化活性強于Kefiran-G，原因是由于2種胞外多糖在結構上存在差異，還可能是由于2種多糖的提取方式存在不同，提取Kefiran-G是采用了水浴加熱的方式，高溫可能破壞多糖結構從而影響多糖的生物活性。

3 結論

開菲爾胞外多糖是1種具有不同生物學和功能性質的益生菌胞外多糖，引起了眾多研究者的關注。過去的研究主要集中于開菲爾粒中Kefiran-G的結構表征及其豐富的功能特性。本研究對比了2種原料提取的開菲爾胞外多糖在結構、理化特性及抗氧化活性上的差異。結果表明，開菲爾粒中的胞外多糖(Kefiran-G)的含量及提取率均優(yōu)于開菲爾發(fā)酵乳中的胞外多糖(Kefiran)，且Kefiran-G因其邊緣的枝狀結構以及枝狀結構末端黏附的球狀結構，具有良好的乳化活性和絮凝活性；Kefiran相較Kefiran-G具有良好的抗氧化活性。后期通過結構測定，進一步研究2種來源胞外多糖的構效關系，為開菲爾胞外多糖更好地用于食品和醫(yī)藥工業(yè)提供一定的數(shù)據(jù)基礎。