劉文平，梁烜赫，張春宵，李淑芳，曹鐵華*，李曉輝*

（1．吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，吉林 公主嶺 136100；2．吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，吉林 長(zhǎng)春 130033；3．吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物資源研究所，吉林 公主嶺 136100）

氮素是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的大量元素之一，是氨基酸、核酸和葉綠素等不可缺少的組成成分。土壤中的氮含量會(huì)嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，氮含量低時(shí)，植株的根不斷伸長(zhǎng)，側(cè)根數(shù)量增多，生長(zhǎng)變慢、分枝和分蘗都變少［1-2］。土壤中的氮素會(huì)被細(xì)菌硝化成硝酸鹽，所以土壤中通常存在大量的硝酸鹽，是植物獲取氮素的主要來源。由于植物不能像動(dòng)物一樣自由移動(dòng)，為了適應(yīng)不同的氮素環(huán)境條件，進(jìn)化出了復(fù)雜巧妙的調(diào)控機(jī)制去適應(yīng)時(shí)刻變化的外界環(huán)境。植物從土壤中吸收硝酸鹽是一個(gè)復(fù)雜的生物過程，包括硝酸鹽吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和同化等［3-4］。經(jīng)過長(zhǎng)期的進(jìn)化過程，硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因是一個(gè)多基因的基因家族，這些基因在植株不同部位特異表達(dá)，基因功能也各不相同，并且存在一因多效的基因。在整個(gè)生物過程中，需要不同的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因在植株的不同部位各司其職并共同調(diào)控作用才能完成。植物通過根系細(xì)胞膜上的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白吸收硝酸鹽，然后從根部細(xì)胞向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)，經(jīng)過木質(zhì)部和韌皮部的裝載及卸載，最后轉(zhuǎn)運(yùn)到葉片細(xì)胞，被同化或者被儲(chǔ)存在液泡中［5-6］。

提高作物的產(chǎn)量主要是通過增施氮肥，但是大量施用氮肥不僅會(huì)造成能源的浪費(fèi)和生產(chǎn)成本的增加，還會(huì)加劇土壤酸化和水體的富營(yíng)養(yǎng)化。為了提高氮肥利用效率，闡明植物如何從土壤中獲取氮素的分子機(jī)理是植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)科的研究熱點(diǎn)之一。近年來，前人從植物的根、莖、葉等部位和從細(xì)胞水平到分子水平對(duì)植物氮素吸收利用進(jìn)行了深入研究，全面闡述植物是如何從外界環(huán)境中吸收氮素，轉(zhuǎn)運(yùn)到植株的不同部位，并進(jìn)行同化利用［7］。本文綜述了植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因的研究進(jìn)展，以期利用基因編輯技術(shù)對(duì)NRT關(guān)鍵基因進(jìn)行編輯，提高NRT蛋白對(duì)硝酸鹽的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和再分配的效率，提高植株對(duì)氮素的利用效率，培育氮高效利用的作物品種，以減少氮肥的投入，從而實(shí)現(xiàn)節(jié)能減排的作物可持續(xù)生產(chǎn)。

1 硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因

硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因在植物中對(duì)硝酸鹽的吸收利用具有至關(guān)重要的作用。硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因家族成員十分復(fù)雜，在功能上也不相同，它們的組織特異表達(dá)部位各不相同［1，8］。已被鑒定的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因成員主要分為4大類：NRT1（Nitrate transporter1/peptide family）、NRT2、CLC（Chloride channel）和SLAC/SLAH（Slow anion channel-associated homologues）［9］。為了高效地從土壤中吸收硝酸鹽，植物進(jìn)化出不同功能的NRT基因，這些基因的功能從控制根系發(fā)育、地下部向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)硝酸鹽，到氮素的儲(chǔ)存和再分配等，從而形成了復(fù)雜的氮素吸收信號(hào)通路。在環(huán)境中硝酸鹽濃度低時(shí)，植物從外界環(huán)境中吸收硝酸鹽主要是硝酸鹽高親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在發(fā)揮作用；反之，在環(huán)境中的硝酸鹽濃度高時(shí)，植物從外界環(huán)境中吸收硝酸鹽的系統(tǒng)是低親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，在已鑒定NRT1基因成員中主要包括NRT1.1和NRT1.2基因；NRT1.1基因是個(gè)例外，它是硝酸鹽雙親和基因［10-11］。這些不同的NRT基因在氮吸收信號(hào)通路中發(fā)揮不同的作用，并且也影響植物的性狀。

1.1 硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因在硝酸鹽吸收中的作用

氮素來源于土壤，在整個(gè)生育期植物如何從土壤環(huán)境中吸取氮源是至關(guān)重要的第一步。植物硝酸鹽吸收轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)通路中，被鑒定的第一個(gè)硝酸鹽雙親和基因是NRT1.1（CHL1/NPR6.3），它是植物根系細(xì)胞中硝酸鹽的受體，能開關(guān)硝酸鹽信號(hào)途徑中其他基因的表達(dá)［12］。在氮素充足的條件下，與對(duì)照植株相比，擬南芥nrt1.1突變體的硝酸鹽含量下降了45%［13］；在0.2 mmol/L硝酸鹽條件下，擬南芥nrt2.1/2.2雙突變體植株的硝酸鹽吸收率下降了50%；而nrt1.1/2.1/2.2三突變體植株則比雙突變體植株的硝酸鹽吸收率下降更多，達(dá)到38%，并且三突植株比二突植株生長(zhǎng)遲緩。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NRT1.1是植株在低氮素生長(zhǎng)條件下吸收硝酸鹽必不可少的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［12］。NRT1.1在硝酸鹽低親和與高親和模式的轉(zhuǎn)換依賴于外界環(huán)境中硝酸鹽的濃度，在蛋白的第101位點(diǎn)蘇氨酸磷酸化和去磷酸化影響著該蛋白的功能。磷酸化會(huì)改變NRT1.1的二聚化以及構(gòu)象，這個(gè)位點(diǎn)是開閉AtNRT1.1蛋白硝酸鹽高親和與低親和模式轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵氨基酸。在外界環(huán)境氮素充足的條件下，這個(gè)位點(diǎn)不被磷酸化，采取硝酸鹽低親和模式吸收硝酸鹽；當(dāng)外界的硝酸鹽濃度變低時(shí)，AtNRT1.1蛋白該位點(diǎn)的蘇氨酸被磷酸化，采用硝酸鹽高親和模式吸收硝酸鹽［14-15］。

擬南芥NRT1.1既是硝酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，也是側(cè)根中生長(zhǎng)素的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；NRT1.1通過調(diào)控根系的生長(zhǎng)素分布，從而控制側(cè)根的形成和生長(zhǎng)［16-17］。在低氮素條件下，擬南芥nrt1.1突變體植株在側(cè)根積累了大量生長(zhǎng)素；NRT1.1朝遠(yuǎn)離側(cè)根頂端方向轉(zhuǎn)運(yùn)生長(zhǎng)素，導(dǎo)致側(cè)根頂端的生長(zhǎng)素含量變低，側(cè)根的生長(zhǎng)受到抑制［18-20］。擬南芥NRT1.2蛋白是硝酸鹽低親和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它的表達(dá)與NRT1.1基因不同，是組成型表達(dá)，但也是在根系中表達(dá)。在氮素充足的培養(yǎng)條件下，與對(duì)照相比，nrt1.2突變體植株的硝酸鹽含量下降［21-23］。在水稻和玉米中，與擬南芥NRT1.1為同源基因，功能與擬南芥相似，都具有吸收硝酸鹽的功能。水稻OsNRT1.1B是硝酸鹽低親和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，也在水稻的根系表達(dá)，控制植株從土壤中吸收硝酸鹽［1，24-25］。OsNRT1.1B蛋白還能轉(zhuǎn)運(yùn)硒元素，把硒元素從地下部向地上部運(yùn)輸，OsNRT1.1B基因過表達(dá)的水稻植株谷粒硒元素含量比對(duì)照高1.83倍［26］。玉米中與擬南芥AtNRT1.1蛋白序列相似度達(dá)到67%的2個(gè)基因分別是ZmNRT6.4和ZmNRT6.6，只有ZmNRT6.6基因的表達(dá)響應(yīng)硝酸鹽。ZmNPF6.6也是一個(gè)硝酸鹽雙親和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，ZmNPF6.6蛋白的第104位點(diǎn)蘇氨酸的改變，影響ZmNPF6.6的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)活性，這個(gè)位點(diǎn)對(duì)應(yīng)擬南芥NRT1.1的第101位點(diǎn)；而第362位點(diǎn)的組氨酸改變，會(huì)導(dǎo)致ZmNPF6.6基因失去吸收硝酸鹽的功能。在低氮水培條件下，ZmNPF6.6蛋白在氮吸收高效玉米雜交種中的表達(dá)量比氮吸收低效雜交種高，而且在處理48 h后，氮吸收高效玉米吸收的硝酸鹽含量超過了氮吸收低效玉米含量的50%～60%。ZmNPF6.6基因是否是玉米中感知硝酸鹽的受體目前尚未確定，是否如同擬南芥AtNRT1.1基因一樣調(diào)控側(cè)根的生長(zhǎng)和其他NRTs基因的表達(dá)也尚未報(bào)道［27-29］。

NRT2基因成員的表達(dá)受到硝酸鹽的誘導(dǎo)，該家族成員中主要有NRT2.1、NRT2.2、NRT2.4和NRT2.5基因，在根系的硝酸鹽吸收中發(fā)揮作用［19，30-31］。在 低 氮 條 件 下，主 要 是NRT2.1和NRT2.2蛋白在硝酸鹽吸收中起重要的作用，它們的表達(dá)量會(huì)迅速增加；NRT2.4和NRT2.5蛋白則是在植物處于缺氮的條件下發(fā)揮功能，NRT2.4是在植株氮素極低時(shí)才發(fā)揮功能；NRT2.5是在植株處于長(zhǎng)時(shí)間氮素缺乏時(shí)，其表達(dá)量才開始上升，成為氮高效吸收的主要基因［9，32-33］。通過細(xì)胞定位和免疫印跡發(fā)現(xiàn)，擬南芥NRT2.1基因在根的細(xì)胞壁表達(dá)［34］。與對(duì)照相比，擬南芥nrt2.1的突變體植株硝酸鹽吸收效率降低了75%，突變體的側(cè)根長(zhǎng)度反而比對(duì)照長(zhǎng)；在長(zhǎng)期低氮條件下，突變體植株生長(zhǎng)嚴(yán)重受到影響。NRT2.1蛋白既在低氮環(huán)境中吸收硝酸鹽，又協(xié)調(diào)了根系的發(fā)育［33，35-36］。擬南芥NRT2.2基因的表達(dá)也是受到硝酸鹽的誘導(dǎo)，但是表達(dá)量不高，主要在植物的根系部位表達(dá)；nrt2.2突變體植株的硝酸鹽含量也是比對(duì)照低，影響植物從外界環(huán)境中吸收硝酸鹽［37-38］。擬南芥AtNRT2.4基因的蛋白序列與NRT2.1和NRT2.2的蛋白序列具有很高的同源性。在缺氮條件下，AtNRT2.4基因在NRT2成員中的表達(dá)量是最高的；但是氮充足條件下，會(huì)抑制它的表達(dá)［39］。在長(zhǎng)時(shí)間缺氮條件下，擬南芥AtNRT2.5基因的表達(dá)量迅速增加，它的表達(dá)量比NRT2.1和NRT2.2基因高。在nrt2.1突變體植株中過表達(dá)NRT2.5基因，過表達(dá)植株的硝酸鹽吸收量比對(duì)照顯著提高。在nrt2.5突變體植株中，硝酸鹽含量明顯比對(duì)照低，只達(dá)到對(duì)照的63%［40-41］。NRT2.5基因在不同的植物中表達(dá)部位略有不同。在擬南芥、玉米和小麥中都在根和葉中表達(dá)，在擬南芥和小麥的種子中也有表達(dá)，在玉米雌穗、穗軸和苞葉中也有表達(dá)。玉米ZmNRT2.5基因的表達(dá)量也受到低氮的誘導(dǎo)，主要是在植株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期表達(dá)，在生殖生長(zhǎng)時(shí)期的根中反而不表達(dá)，但是在苞葉中高表達(dá)，苞葉對(duì)籽粒灌漿期的氮素分布發(fā)揮著關(guān)鍵作用［32］。

目前，對(duì)NRT2基因的蛋白修飾研究報(bào)道不是很多。通過對(duì)NRT2.1的磷酸化研究發(fā)現(xiàn)，NRT2.1存在3個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中一個(gè)位點(diǎn)在其N端第28個(gè)絲氨酸，植株在低氮條件下該位點(diǎn)被磷酸化；反之，在補(bǔ)充了氮的培養(yǎng)條件下，該位點(diǎn)迅速去磷酸化，可能是通過該位點(diǎn)的去磷酸化調(diào)控NRT2.1在低氮和高氮條件下硝酸鹽的吸收活性。然而，第501位點(diǎn)蘇氨酸的磷酸化，只是影響了NRT2.1硝酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)活性［33，42-43］。通過爪蟾卵母細(xì)胞和酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NRT2.1和NAR2.1蛋白互作后，才能夠形成吸收硝酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。擬南芥NRT2.1基因的表達(dá)量在nar2.1突變體中仍然很高，但是在細(xì)胞膜上看不見NRT2.1；NAR2.1與NRT2.1互作激活了NRT2.1的功能，NAR2.1蛋白對(duì)于NRT2.1蛋白的穩(wěn)定具有極其重要的作用［42，44-47］。然而，在其他植物中也會(huì)有例外。水稻的OsNRT2.3b和OsNRT2.4蛋白不用與OsNAR2.1互作就能發(fā)揮吸收氮素的功能。OsNRT2.3b基因主要在韌皮部表達(dá)，它的功能是通過對(duì)pH值的變化來感知，從而開關(guān)硝酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)活性；其在水稻中過表達(dá)，能提高植株的pH緩沖能力和增加氮、鐵和磷的吸收，提高了植株40%的氮素利用效率［48-49］。

玉米ZmNRT2.1和ZmNRT2.2基因的蛋白序列相似性達(dá)到98%，它們?cè)诟械谋磉_(dá)受到硝酸鹽的誘導(dǎo)；ZmNRT2.1基因在根中特異表達(dá)，ZmNRT2.2基因則在皮層和側(cè)根的原基表達(dá)［50-51］。通過爪蟾細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，ZmNRT2.1蛋白是硝酸鹽高親和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它的功能是從外界環(huán)境吸收硝酸鹽，ZmNRT2.1也是需要和NAR2.1互作才能發(fā)揮作用［52-54］。玉米ZmNRT2.1基因在煙草中過表達(dá)，在高氮素條件下，轉(zhuǎn)基因煙草比對(duì)照的根系生長(zhǎng)旺盛，而且生物量也比對(duì)照高，但轉(zhuǎn)基因煙草與對(duì)照植株的硝酸鹽含量沒有明顯的差異［55］。水稻OsNRT2.1基因在水稻中過表達(dá)能增強(qiáng)植株的根長(zhǎng)，硝酸鹽含量比對(duì)照植株高24.3%［55-56］。

植物既有對(duì)硝酸鹽的吸收，也存在對(duì)硝酸鹽外排的現(xiàn)象，但是外排的生理機(jī)制尚不清楚［19］。在沒有外界脅迫壓力下，植物硝酸鹽外排量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于吸收量。在脅迫條件下，擬南芥NAXT1蛋白可能是通過對(duì)硝酸鹽的外排，從而能夠調(diào)控細(xì)胞的滲透壓［57］。植株生長(zhǎng)在氮素充足的土壤中，根系會(huì)很發(fā)達(dá)，側(cè)根數(shù)量很多。植株在氮素含量變低的情況下，根系會(huì)迅速往土壤深層生長(zhǎng)，促進(jìn)根的伸長(zhǎng)去吸收深層土壤中的氮素。土壤環(huán)境中的氮素量對(duì)植物根系的生長(zhǎng)存在調(diào)節(jié)，適量的氮素可刺激植株側(cè)根的生長(zhǎng)。硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的信號(hào)通路與控制根系的發(fā)育是如何相互交叉在一起的，還需要進(jìn)一步的研究［18，58-59］。

1.2 硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因在硝酸鹽運(yùn)輸中的作用

植物從土壤環(huán)境中獲取到氮源，需要把氮源運(yùn)輸?shù)教囟ńM織，這離不開對(duì)硝酸鹽的運(yùn)輸。因此，植物對(duì)氮素的運(yùn)輸是制約氮素利用效率提高的重要環(huán)節(jié)之一。植株從外界環(huán)境吸收的硝酸鹽需要從根部運(yùn)輸?shù)街仓甑牟煌课?，維管束組織在植株地上部和地下部的物質(zhì)運(yùn)輸中具有舉足輕重的地位［60-61］。NRT1.5基因在根系的中柱鞘細(xì)胞表達(dá)，它的功能是將硝酸鹽從中柱細(xì)胞裝載入木質(zhì)部，負(fù)責(zé)把硝酸鹽從地下部向地上部運(yùn)輸。與對(duì)照相比，nrt1.5突變體在根系積累的硝酸鹽量比對(duì)照植株高。在硝酸鹽長(zhǎng)距離運(yùn)輸途徑中，NRT1.5基因不是植物中唯一的硝酸鹽運(yùn)輸途徑，還存在其他NRT基因或別的基因控制硝酸鹽的運(yùn)輸［62-63］。盡管NRT1.5和NRT1.8基因在進(jìn)化關(guān)系上非常近，然而二者在根和莖部位的表達(dá)量卻恰恰相反，NRT1.5基因在根中的表達(dá)量比莖部位高，NRT1.8基因則正好相反，它們?cè)谙跛猁}信號(hào)途徑中的功能也是相反的。NRT1.8基因還可以在木質(zhì)部的薄壁細(xì)胞中特異表達(dá)。硝酸鹽經(jīng)過長(zhǎng)距離運(yùn)輸后，需要分配到不同的組織部位中進(jìn)行同化，NRT1.8基因的功能是卸載木質(zhì)部中的硝酸鹽［64］。然而，NRT1.5控制硝酸鹽從地下部組織向地上部組織運(yùn)輸，在根系需要大量硝酸鹽時(shí)，硝酸鹽也能把儲(chǔ)存在葉片中的硝酸鹽向地下部組織運(yùn)輸［11］。NRT1.9基因在植株根的韌皮部伴生細(xì)胞中特異表達(dá)，負(fù)責(zé)將硝酸鹽裝載入韌皮部向下運(yùn)輸。擬南芥nrt1.9突變體植株的地上部積累了大量的硝酸鹽，NRT1.9蛋白在硝酸鹽從地下部向地上部的運(yùn)輸過程中起到負(fù)調(diào)控作用，它可能是作為一個(gè)安全閥，調(diào)控地上部和地下部硝酸鹽含量的分配。如果增加植株地上部對(duì)硝酸鹽的同化能力和葉片對(duì)多余硝酸鹽儲(chǔ)存的能力，能否促使植物從土壤中吸收大量的硝酸鹽，特別是在籽粒形成時(shí)期，大量?jī)?chǔ)存的氮素被再利用，并通過代謝過程成為籽粒的成分？目前，關(guān)于植物根系如何將硝酸鹽從地下部向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)的分子調(diào)控水平研究報(bào)道不多［65］。

與擬南芥AtNRT1.8蛋白同源的水稻OsNPF7.2也是硝酸鹽低親和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它在根的厚壁組織、皮層和葉脈中表達(dá)。它的功能可能與擬南芥的基因功能相似，負(fù)責(zé)硝酸鹽的裝載和卸載［51，66］。水稻OsNPF2.4是一個(gè)在根系部位表達(dá)的硝酸鹽雙親和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在硝酸鹽吸收中起到重要的作用，也控制硝酸鹽的長(zhǎng)距離轉(zhuǎn)運(yùn)和再分配；與對(duì)照相比，水稻osnrt2.4突變體植株的側(cè)根數(shù)量會(huì)減少、長(zhǎng)度也會(huì)變短，硝酸鹽吸收量也會(huì)減少，表型和功能與擬南芥NRT1.1基因相似［67-68］。水稻OsNRT2.3a是擬南芥AtNRT2.5的同源基因，OsNRT2.3a蛋白需要和OsNAR2.1互作才能調(diào)控對(duì)硝酸鹽的吸收，也控制硝酸鹽從地下部向地上部的運(yùn)輸；在水稻中過表達(dá)OsNRT2.3a基因，不僅能增強(qiáng)大田中水稻在高氮素或者低氮素條件下對(duì)硝酸鹽吸收的能力，還能提高水稻的產(chǎn)量和氮素利用效率［32，69］。

1.3 硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因在硝酸鹽儲(chǔ)存中的作用

植物在不同生長(zhǎng)階段對(duì)氮素的需求量不同，硝酸鹽的吸收和同化存在一個(gè)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，植物建立了體內(nèi)多余硝酸鹽的儲(chǔ)存機(jī)制，存儲(chǔ)的硝酸鹽則可作為后期大量需求氮素的主要來源之一。植物吸收的硝酸鹽在被同化利用后，大約99%剩余的硝酸鹽被儲(chǔ)存在葉片的液泡中。擬南芥AtNRT1.4基因在葉片的葉柄部位和主脈處特異表達(dá)，不受硝酸鹽的誘導(dǎo)；在葉柄和葉片主脈處的硝酸鹽含量很高，且硝酸鹽還原酶活性低。nrt1.4突變體植株的葉柄和葉片主脈處的硝酸鹽含量只有對(duì)照的45%～50%。NRT1.4基因也影響了葉片的生長(zhǎng)，突變體比對(duì)照植株的葉片寬；葉片負(fù)責(zé)硝酸鹽儲(chǔ)存的基因不止一個(gè)，但只有AtNRT1.4基因已被鑒定［70］。可能是因?yàn)镹RT基因數(shù)量太多，同一個(gè)基因在不同的部位發(fā)揮的作用會(huì)有所不同，且同一功能又同時(shí)存在多個(gè)NRT基因發(fā)揮同樣的作用，這使控制硝酸鹽儲(chǔ)存的基因鑒定及其困難。

1.4 硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因在籽粒中的作用

植物在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段體內(nèi)儲(chǔ)存了大量的硝酸鹽，這些硝酸鹽是植株后期生殖生長(zhǎng)需要的氮源。這部分氮素的再利用是提高氮素利用效率和提高產(chǎn)量至關(guān)重要的一步。在籽粒形成過程中，特別是小麥和玉米葉片中氮素被再利用占據(jù)了籽粒中氮素的50%～90%［71］。擬南芥AtNRT1.7基因在葉片的葉脈韌皮部特異表達(dá)，它的功能是負(fù)責(zé)將老葉片中的硝酸鹽裝載入韌皮部，并運(yùn)輸?shù)叫律~片中，調(diào)控氮素從源到庫(kù)的再利用。擬南芥AtNRT1.6基因在生殖生長(zhǎng)期的長(zhǎng)角果中特異表達(dá)，在植株授粉后，AtNRT1.6基因的表達(dá)量迅速增加，其功能是參與硝酸鹽向種子的運(yùn)輸。nrt1.6突變體種子的氮含量也比對(duì)照低，突變體也出現(xiàn)胚發(fā)育不正常的現(xiàn)象，達(dá)到40%，嚴(yán)重影響結(jié)實(shí)率。在nrt1.6突變體植株種子形成過程中的1～4個(gè)細(xì)胞發(fā)育階段就會(huì)出現(xiàn)發(fā)育不正常的胚。NRT2.7基因是在種子形成的后期表達(dá)，特別是在種子的成熟后期；NRT2.7基因有助于種子胚的成熟。在nrt2.7突變體植株的胚形成過程中，早期的胚發(fā)育正常，只是在后期出現(xiàn)異常。NRT1.6和NRT2.7在種子的形成過程中，在不同的階段和部位發(fā)揮功能，確保種子中氮素的運(yùn)輸和儲(chǔ)存。擬南芥nrt2.7的突變體種子的硝酸鹽含量比對(duì)照低，但是氨基酸和淀粉等物質(zhì)的含量不受影響。AtNRT2.7基因在后期胚的成熟過程中是否還與硝酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，尚不清楚［72-74］。

2 硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因在植物育種中的利用

氮素從根系運(yùn)輸?shù)饺~片中儲(chǔ)存，在植株后期大量需求氮素時(shí)作為主要氮源之一［21］。硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的特定部位表達(dá)模式?jīng)Q定了其在植株體內(nèi)的功能。AtNRT1.7基因的功能是負(fù)責(zé)把儲(chǔ)存的硝酸鹽裝載入韌皮部，并轉(zhuǎn)運(yùn)到新生的葉片中；通過基因克隆等技術(shù)選擇NRT1.1基因的第2～5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和NRT1.2基因的N端第1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)氨基酸序列及后6個(gè)膜結(jié)構(gòu)氨基酸序列組建一個(gè)全新的NRT（NC4N）基因，再利用NRT1.7基因的啟動(dòng)子使NC4N基因在特異部位表達(dá)；利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)把NC4N基因分別轉(zhuǎn)入擬南芥、煙草和水稻中，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的產(chǎn)量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，NC4N基因提高了擬南芥、煙草和水稻的生物量，收獲的種子數(shù)量也比對(duì)照高。在這3種植株中老葉片的含氮量比對(duì)照低，不僅在植株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期，而且在生殖生長(zhǎng)時(shí)期也促進(jìn)了植株中氮素的再轉(zhuǎn)化。這證實(shí)了提高植株氮素從源到庫(kù)的轉(zhuǎn)運(yùn)，可以提高植株的氮素利用效率［75］。

在多年的進(jìn)化和馴化過程中，植物基因出現(xiàn)了自然變異和選擇壓力的變異，這些位點(diǎn)的變異可以微調(diào)這些基因功能，最終表現(xiàn)在這些基因如何參與具體的生物過程［76］。Hu等［24］通過分析秈、粳稻的OsNRT1.1B基因序列多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)兩者的氮吸收效率差異是因?yàn)镺sNRT1.1B基因的一個(gè)氨基酸的變異所導(dǎo)致，通過基因編輯技術(shù)改變其位點(diǎn)，則能提高粳稻的氮素利用效率。在不影響植株正常生長(zhǎng)的前提下，通過對(duì)氮素利用途徑中多個(gè)關(guān)鍵基因的過表達(dá)和多個(gè)基因組合共表達(dá)，有利于提高產(chǎn)量［77］。NRT2需要與NAR2.1互作才能發(fā)揮氮素吸收效率，同時(shí)在水稻中過表達(dá)OsNAR2.1基因和OsNRT2.3a基因，田間測(cè)產(chǎn)表明過表達(dá)基因植株比對(duì)照增加了24.6%的產(chǎn)量；單獨(dú)過表達(dá)OsNAR2.1基因，只增加了14.1%的產(chǎn)量。Liu等［78］研究發(fā)現(xiàn)，在少施氮肥條件下，與對(duì)照植株相比較，OsTCP19基因能夠提高水稻20%～30%的氮肥利用率。然而，隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的氮肥施用，OsTCP19基因在大量水稻品種中逐漸消失。OsTCP19蛋白既能抑制DLT基因的表達(dá)，也與OsABI4和OsULT1等蛋白互作，參與到ABA、發(fā)育信號(hào)等多條信號(hào)通路；在水稻的氮素利用通路中，也影響了相關(guān)的NRT基因的功能發(fā)揮。因此，通過研究與NRT互作的關(guān)鍵基因，也可能挖掘到影響農(nóng)藝性狀至關(guān)重要的基因。

3 展望

植物對(duì)氮素的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)存、同化和再利用是多個(gè)基因和環(huán)境因子共同作用的結(jié)果。硝酸鹽被根系吸收、硝酸鹽在木質(zhì)部和韌皮部裝載運(yùn)輸和在液泡中儲(chǔ)存等整個(gè)生物過程中，不同類型的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)雜催化結(jié)構(gòu)的差異，導(dǎo)致了吸收硝酸鹽能力和功能等方面的差異［79-80］。硝酸鹽吸收存在多個(gè)調(diào)控模塊，目前還沒有完全解析吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)的信號(hào)通路。通過對(duì)植物氮素利用途徑的研究，了解這些組成部分是如何相互作用并成為一個(gè)有機(jī)整體而發(fā)揮作用，有利于找到制約植物氮素最大化利用的關(guān)鍵點(diǎn)［81］。隨著對(duì)硝酸鹽的運(yùn)輸和再利用等途徑中基因的挖掘和功能鑒定，可以利用基因編輯等技術(shù)對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行編輯，通過對(duì)關(guān)鍵堿基的替換，改變基因的表達(dá)；從而改變改良品種關(guān)鍵基因的功能，提高植株對(duì)氮素的運(yùn)輸效率和數(shù)量，實(shí)現(xiàn)植物氮素利用效率的提高［10］。例如，水稻OsNRT1.1B基因在粳、秈稻間由于單核苷酸的多態(tài)性而導(dǎo)致氮素利用效率的不同，因此可以通過基因編輯技術(shù)進(jìn)行單堿基的改變［81］。目前，水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因編輯技術(shù)已經(jīng)很成熟，可以通過單堿基的改變，關(guān)閉限制氮素吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、存儲(chǔ)及同化利用相關(guān)基因的表達(dá)，從而改良水稻推廣品種的氮吸收效率，達(dá)到提高水稻產(chǎn)量的目標(biāo)。

NRT基因成員中在吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)硝酸鹽的效率上存在差異，導(dǎo)致差異的原因是關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基的影響。通過對(duì)NRT基因轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域的改造，可以提高其轉(zhuǎn)運(yùn)硝酸鹽的效率。對(duì)NRT1.7基因的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)進(jìn)行改造，提高了NRT1.7基因?qū)Φ貜睦先~片向籽粒的轉(zhuǎn)運(yùn)效率，提高了植株的產(chǎn)量［75］。NRT基因也與其他基因互作，從而參與到其他信號(hào)通路中。NRT1.1/NRT2.1基因的表達(dá)量提高會(huì)抑制植物中光響應(yīng)調(diào)節(jié)因子FT和CO基因的表達(dá)，從而影響植株的開花時(shí)間。利用基因編輯技術(shù)在NRT1.1/NRT2.1基因的啟動(dòng)子序列中插入一段序列，提高這兩個(gè)基因的表達(dá)量，從而提高植株對(duì)氮素的吸收和改變開花時(shí)間［82］。

部分NRT基因的功能已經(jīng)得到解析，但是其在某些組織中表達(dá)的生物學(xué)意義尚不清楚。例如：NRT1.1基因在植株的葉柄特異表達(dá)，其功能未能解釋。還需要通過研究該基因在葉柄處互作的蛋白種類，從而推測(cè)其功能。而且對(duì)植株中氮素的儲(chǔ)存研究尚未深入，除了已知的AtNRT1.4基因控制氮素的儲(chǔ)存，其他影響氮素儲(chǔ)存的基因還沒鑒定出來；需要通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)等組學(xué)的結(jié)合，集中研究硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多基因突變體，將有助于鑒定NRT基因在氮素儲(chǔ)存中發(fā)揮的作用。利用酵母單雜交技術(shù)挖掘調(diào)控NRT基因表達(dá)的上游基因和NRT基因啟動(dòng)子中的關(guān)鍵元件，最終增加NRT基因的表達(dá)量，提高植株對(duì)氮素的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)效率。未來的研究可以通過整合信號(hào)途徑中多個(gè)NRT關(guān)鍵基因和調(diào)控因子，達(dá)到操縱硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的活性，增強(qiáng)植株對(duì)硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)等方面的能力。因此，采用多基因表達(dá)的模式，利用過表達(dá)根系吸收氮素基因、組織特異表達(dá)啟動(dòng)子控制籽粒灌漿時(shí)期的NRT基因和其他影響氮素在籽粒積累的基因共同組合成基因簇，提高植物的氮素利用效率［18］；再結(jié)合植物不同生長(zhǎng)時(shí)期的氮肥施用量和田間管理，在顯著減少氮肥施用量的前提下，確保穩(wěn)產(chǎn)或增加產(chǎn)量，來減輕氮肥對(duì)環(huán)境的污染。