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        實(shí)驗(yàn)兔胸腺取材及檢測(cè)方法*

        2022-11-18 11:51:48田岳鳳

        方 慧 田岳鳳

        (1.運(yùn)城第一醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科,運(yùn)城 044000)(2.山西中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床學(xué)院,晉中 030619)

        胸腺是T細(xì)胞發(fā)育成熟的關(guān)鍵,機(jī)體重要的中樞免疫器官之一。它還可以分泌多種胸腺激素及激素類物質(zhì),具內(nèi)分泌功能。胸腺對(duì)于機(jī)體的健康有著十分重要的作用,一些免疫力功能低下或自身免疫疾病、腫瘤的發(fā)生及衰老等與胸腺密切相關(guān)[1]。兔在生物醫(yī)學(xué)中應(yīng)用廣泛,主要用于免疫學(xué)、生物制品、發(fā)熱解熱和檢測(cè)致熱源、生殖生理和避孕藥、眼科學(xué)、骨骼等多個(gè)方面[2]。目前兔在免疫學(xué)的應(yīng)用中,關(guān)于其胸腺的論述較少,這可能與其退化和取材的困難性有關(guān)。因此本文就兔胸腺的發(fā)育退化過程及取材時(shí)的注意事項(xiàng)敘述如下,希望可以對(duì)一些研究有所幫助。

        1 材料和方法

        1.1 動(dòng)物分組

        清潔級(jí)大耳白兔8只,雌雄各半,體質(zhì)量(2.18±0.23)kg,由北京昌揚(yáng)西山養(yǎng)殖場(chǎng)提供【動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(京)2016-0007】,飼養(yǎng)于山西中醫(yī)藥大學(xué)科研樓,實(shí)驗(yàn)室溫度20~25 ℃,相對(duì)濕度45%~65 %,隨機(jī)分為空白組、免疫抑制模型組,每組4只。

        1.2 儀器和試劑

        注射用環(huán)磷酰胺(江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司)(200 mg/瓶,國(guó)藥準(zhǔn)字H32020857),恒溫箱(三洋,MIR-262),石蠟包埋機(jī)(孝感亞光,YB-6LF),顯微鏡(奧林巴斯,BX51)。

        1.3 造模及取材

        實(shí)驗(yàn)以環(huán)磷酰胺制備免疫抑制模型,造模方法以60 mg/kg劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺,連續(xù)造模7 d[7],空白組連續(xù)腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液,飼養(yǎng)20 d后進(jìn)行胸腺組織取材。

        2 結(jié)果

        2.1 一般形態(tài)結(jié)果

        一般形態(tài)結(jié)果顯示,胸腺多呈左、右雙葉狀,質(zhì)地偏硬,與脂肪組織比更有韌性。其中空白組胸腺多呈淡粉色,環(huán)磷酰胺模型組胸腺多呈白色。

        2.2 HE染色結(jié)果

        圖1 兔胸腺HE染色切片(×200)Fig.1 HE staining of thymus from rabbits (×200)

        為了確定取材的結(jié)果及胸腺退化的程度,對(duì)其進(jìn)行HE染色,如圖1:空白組胸腺結(jié)構(gòu)完整,皮髓界限清楚,皮質(zhì)淋巴細(xì)胞密集;免疫抑制模型組胸腺失去正常結(jié)構(gòu),皮髓界限不清,皮質(zhì)淋巴細(xì)胞減少,周圍脂肪組織多。

        3 討論

        3.1 兔胸腺發(fā)育退化過程

        胸腺是機(jī)體重要的中樞免疫器官,動(dòng)物和人的胸腺隨著年齡的增長(zhǎng)均會(huì)逐漸萎縮退化,主要表現(xiàn)為脂肪組織增多、體積變小和初始T淋巴細(xì)胞輸出減少,從而導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降,增加了患感染、腫瘤和自身免疫性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。胸腺這種隨年齡增長(zhǎng)而發(fā)生的形態(tài)改變和功能退化被稱為胸腺增齡性萎縮[3-4]。

        兔胸腺起于頸部,分為左、右兩葉,大部分位于胸腔前縱隔,在胸骨后面并緊靠心臟,表面有薄層結(jié)締組織被膜(圖2)。在兔的生長(zhǎng)發(fā)育期間,幼兔的胸腺最為明顯,長(zhǎng)度約2.5 cm,寬2 cm,厚4 mm。重量為2.3~2.8 g,占總體質(zhì)量的百分比也最高,但是隨著年齡的增加,該器官也發(fā)生著明顯的退行性變化, 主要表現(xiàn)為出現(xiàn)大部分脂肪組織,僅剩下極少的胸腺皮質(zhì)或髓質(zhì),成兔的胸腺幾乎全被脂肪和結(jié)締組織填充[5]。

        圖2 兔胸腺的解剖位置Fig.2 Anatomical location of rabbit thymus

        3.2 具體年齡對(duì)應(yīng)的胸腺狀況

        兔從出生到斷奶的時(shí)期稱為仔兔期,一般為0~35 d;斷奶當(dāng)天至3月齡的時(shí)期稱為幼兔期,整3月齡的家兔平均體質(zhì)量在1.7~2.0 kg;滿3月齡至初配前稱為中兔期也稱后備兔,這個(gè)時(shí)期的家兔4月齡平均體質(zhì)量2.0~2.3 kg,5月齡平均體質(zhì)量在2.5~2.8 kg。一般培養(yǎng)、毒性實(shí)驗(yàn)多使用45~90 d的幼兔,慢性實(shí)驗(yàn)使用90~180 d的兔[6]。就目前取材的胸腺發(fā)現(xiàn):尚未開始退化的胸腺呈粉紅色,開始退化之后的胸腺,顏色偏白,這與其大量的脂肪組織增多有關(guān),可能顏色的變化能說明其退化的程度(圖3)。

        圖3 兔胸腺組織Fig.3 Rabbit thymus tissue

        3.3 取材要點(diǎn)及注意事項(xiàng)

        (1)胸腺位置準(zhǔn)確定位

        將兔麻醉后仰臥位置捆綁固定于兔解剖臺(tái)上,因?yàn)榧彝玫男叵傥挥谛毓呛竺娌⒕o靠心臟,基本位于第1~3肋骨處,所以我們找取胸腺時(shí)多用手術(shù)刀和手術(shù)剪沿腹白線向上打開胸腔,先暴露其心臟,發(fā)現(xiàn)心臟后繼續(xù)向上剪開胸骨,注意此時(shí)的動(dòng)作一定要小心,防止傷及胸腺。在胸腔充分暴露后,多數(shù)情況下會(huì)發(fā)現(xiàn)胸腺就覆蓋在心臟上,呈左、右雙葉狀,還未出現(xiàn)退化情況的胸腺呈淡粉色,已退化的胸腺因組織中脂肪不斷增多其顏色多偏白;還有一些情況會(huì)發(fā)現(xiàn)胸腺?zèng)]有覆蓋在心臟上而是緊貼于胸骨,但是也呈雙葉狀;此外有極少例可能是胸腺已經(jīng)完全退化,并沒有找到胸腺組織。

        (2)明確胸腺的分布區(qū)域

        用手術(shù)鑷夾起覆蓋于心臟上方或胸骨后方的胸腺,稍微向上挑起,會(huì)發(fā)現(xiàn)它起自于兔頸部的位置,肉眼仔細(xì)觀察胸腺起始的這個(gè)區(qū)域,為之后的取材打下基礎(chǔ),防止取材到一半不知道這個(gè)部分是不是自己要的。因?yàn)樾叵倥c縱隔脂肪組織的真正界限比較難以確定,尤其是已經(jīng)發(fā)生退化的胸腺組織。

        (3)取材方法

        因?yàn)樾叵俦砻嬗斜咏Y(jié)締組織被膜,讓其緊貼于心臟上方或胸骨后方,因此在取材的時(shí)候需要用小的手術(shù)剪將其分離,分離后的重點(diǎn)就在于胸腺和頸部連接的部位的處理,這個(gè)時(shí)候千萬要小心,防止出血過多。這是因?yàn)樾叵傺汗?yīng)主要來自于幾條從胸腺四周穿越被膜進(jìn)入小葉間隔的小動(dòng)脈[8]。其血供雖然不是很豐富,但是如果不注意,沿著胸腺與頸部的連接部位隨意處理,會(huì)引起一定的出血,而兔胸腺的顏色呈粉紅色或者淡白色,著色淺而輕薄,這些出血會(huì)和胸腺組織的顏色發(fā)生變化,與周圍組織難以區(qū)分,造成接下來分離的困難。

        取材完畢后,將取下的標(biāo)本放置于0.9%氯化鈉溶液中,把表面的血液清洗后用濾紙擦拭干凈。接下來,用手術(shù)鑷和手術(shù)剪進(jìn)行下一步的工作,因?yàn)橐呀?jīng)發(fā)生退化的胸腺組織與縱隔脂肪組織的界限比較難以區(qū)分,如果對(duì)自己取到的組織不太確定可以用自己的雙手的拇指和食指進(jìn)行揉捏感受一下它的質(zhì)地,正常情況下胸腺的質(zhì)地偏硬比較有韌性,而脂肪組織的質(zhì)地偏軟,沒什么韌性,可以根據(jù)此對(duì)取到的標(biāo)本進(jìn)行進(jìn)一步的確認(rèn)。

        綜上可知,隨著年齡增長(zhǎng),兔胸腺會(huì)不斷退化,有的甚至消失,并且經(jīng)環(huán)磷酰胺制備的免疫抑制模型后,兔胸腺組織形態(tài)也發(fā)生明顯的不可逆的改變。

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