黃亞林 牛世偉 龔紅霞 蘇 韞 張 晗 曾元丁 李菲菲

(1.甘肅省靖遠縣人民醫(yī)院，白銀 730600)(2.甘肅中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，蘭州 730000)(3. 甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學與中醫(yī)藥防治研究省級重點實驗室，蘭州 730000)(4.甘肅中醫(yī)藥大學公共衛(wèi)生學院，蘭州 730000)

胃癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，是造成我國癌癥死亡的第二大原因[1]。胃癌的典型特征是無限的增殖和異常凋亡[2]。癌細胞的增殖同腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及臨床治療密切相關。大量研究表明，多條信號通路與胃癌的發(fā)生發(fā)展關系密切，如表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)通路[3]、IL-6/JAK/STAT通路[4]、PI3K/Akt/mTOR通路[5]、NF-κB/Bcl-2通路[6]和Shh通路[7]等。其中IL-6/JAK2(Janus proteintyrosine kinase 2)/STAT3(signal transducer and activator of transcription 3)信號通路在胃腸道腫瘤發(fā)生過程中高度特異性激活，從促炎、促增殖、促血管生成、抗凋亡、免疫調節(jié)等多個方面促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。阻斷該通路可能為胃癌的治療提供新的思路。因此，本實驗選用通路特異性阻斷劑阻斷該通路關鍵靶點，驗證通路下游靶點蛋白的表達，探討IL-6/JAK2/STAT3信號通路在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 動物及細胞

SPF級KM小鼠48只，雌雄各半，體質量(20.0±2.0)g，由甘肅中醫(yī)藥大學SPF級動物實驗中心提供。動物合格證號【SCXK(甘)2020-0001】。本實驗由甘肅中醫(yī)藥大學倫理委員會審查，倫理審批號：2020-283。MFC小鼠胃癌細胞株，批號為PNS-MC-20【武漢普諾賽生命科技有限公司】。

1.2 主要試劑

AG490和Stattic(Selleck生物科技有限公司)；RPMI 1640 培養(yǎng)液(Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；Trizol(Ambion公司)；RT-qPCR試劑盒(上海翊圣生物有限公司)；免疫組化(IHC)試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；兔抗鼠IL-6(GenTex公司)；p-JAK2、p-STAT3、c-Myc和Cyclin D1抗體(Immunoway公司)。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1細胞培養(yǎng)及胃癌荷瘤小鼠模型的建立：小鼠MFC胃癌細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃，5%CO2孵育箱中。將MFC細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期并將濃度調整為1×107個/mL，小鼠右側腋下常規(guī)消毒后，接種細胞懸浮液0.2 mL/只，建立胃癌荷瘤小鼠模型。接種5～7 d可觸及結節(jié)，結節(jié)直徑長至大于5 mm時表示造模成功。

1.3.2動物分組及給藥：根據(jù)隨機數(shù)字表法將造模成功的胃癌荷瘤小鼠隨機分為模型組、AG490阻斷劑組和Stattic阻斷劑組，每組10只。根據(jù)小鼠和人體表面面積比值0.002 6計算小鼠給藥劑量，每天AG490為8 mg/kg，Stattic為5 mg/kg。另選12只健康小鼠作為空白組，小鼠的灌胃體積和腹腔注射體積為0.2 mL，給藥周期為14 d，模型組和空白組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液。實驗過程中，剔除腫瘤直徑小于5 mm的小鼠4只，腹腔注射給藥時意外死亡2只。

1.3.3測定瘤體質量及計算抑瘤率：末次給藥24 h后，頸椎脫臼法犧牲小鼠，摘除瘤體組織稱重并記錄。抑瘤率=(模型組平均瘤質量-藥物組平均瘤質量)/模型組平均瘤質量×100%。

1.3.4ELISA檢測IL-6含量：小鼠眼球取血，分離血清，-80 ℃冰箱保存。實驗過程按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中IL-6的含量。

1.3.5免疫組化染色觀察各組小鼠瘤體組織中蛋白表達情況：取甲醛固定的組織，石蠟包埋，切片后二甲苯中脫蠟，梯度乙醇脫去二甲苯，3% H2O2甲醇消除內(nèi)源性過氧化氫酶，然后用檸檬酸鈉修復液對其進行高溫修復，加入相應一抗工作液于4 ℃，冰箱保存，PBS清洗后加入二抗，37 ℃孵育2 h。DAB顯色后用蘇木精染液復染，乙醇二甲苯脫水后透明，最后封片于顯微鏡下觀察拍片。Image J軟件進行圖像分析。

1.3.6RT-qPCR定量檢測瘤體組織中各基因的表達：取瘤體組織100 mg，Trizol法提取總RNA；經(jīng)反轉錄試劑盒將mRNA反轉錄為cDNA，在-80 ℃冰箱中保存。采用SYBR法在CFX96熒光定量PCR儀中檢測各mRNA表達，20 μL反應體系，反應條件為95 ℃、5 min，95 ℃、10 s，55 ℃、20 s，72 ℃、20 s，40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，通過 2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。GAPDH的正向引物序列為5′-gTgCTgAgTATgTCgTggAgTC-3′；反向序列為5′-ACAgTCTTTCTgggTggCAgT-3′；IL-6的正向引物序列為5′-CATCCAgTTgCC TTCTTg-3′，反向序列為5′-TATCCAgTTTggTAg CATCC-3′；JAK2的正向引物序列為5′-ACAATgACAgAAATggAggC-3′，反向序列為5′-ACAggCgTAATACCACAAgC-3′；STAT3的正向引物序列為5′-TgTTggAgCAgCAtTCTTC-3′，反向序列為5′-ggTCACAgACTggTTgTTTC-3′；c-Myc的正向引物序列為5′-gAgATgATgACCgAgTTACTTg-3′，反向序列為5′-AACCgCTCCACATACAgTC-3′；Cyclin D1的正向引物序列為5′-ggATgAgAA CAAgCAgAC-3′，反向序列為5′-TAgCAggAgAggAAg TTg-3′。

1.3.7蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測組織IL-6、p-JAK2、p-STAT3、c-Myc和CyclinD1蛋白表達：取適量瘤體組織提取蛋白，按照BCA法檢測蛋白濃度，煮沸變性，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。配制SDS-PAGE膠，電泳，將蛋白轉移至PVDF膜后5%脫脂奶粉封閉2 h，于一抗稀釋液中4 ℃冰箱過夜。TBST清洗后于常溫搖床二抗孵育2 h，ECL顯色曝光，使用Image J軟件對蛋白條帶灰度值進行分析，與內(nèi)參進行比較，分析相對蛋白表達量。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 實驗干預對胃癌荷瘤小鼠瘤體質量及抑瘤率的影響

與模型組比，AG490阻斷劑組和Stattic阻斷劑組小鼠的瘤體質量顯著下降(P<0.01)，抑瘤率分別為40.11%、37.14%，見表1。

表1 各組小鼠瘤體質量及抑瘤率Table 1 Tumor mass and tumor inhibition rate of mice

2.2 ELISA檢測胃癌荷瘤小鼠血清中IL-6表達情況

與空白組比，模型組小鼠血清中IL-6含量升高(P<0.01)；與模型組比，AG490阻斷劑組和Stattic阻斷劑組小鼠血清中IL-6含量下降(P<0.01)，見表2。

表2 各組小鼠血清中IL-6水平的比較Table 2 Comparison of IL-6 levels in serum of

2.3 免疫組化檢測胃癌荷瘤小鼠瘤體組織中蛋白表達情況

與模型組比，AG490阻斷劑組和Stattic阻斷劑組小鼠瘤體組織中IL-6、JAK2、STAT3、c-Myc和Cyclin D1的陽性表達顯著下降(P<0.05，P<0.01)，見圖1，表3。

注：A.模型組；B.AG490 阻斷劑組；C.Stattic阻斷劑組Note: A.Model group;B. AG490 blocker group;C.Stattic blocker group圖1 各組小鼠瘤體組織中IL-6、JAK2、STAT3、c-Myc和Cyclin D1含量表達Fig.1 The expression of IL-6, JAK2, STAT3, c-Myc and Cyclin D1 in tumor tissues of each group of mice

表3 免疫組化檢測各組小鼠瘤體組織中蛋白表達情況Table 3 Immunohistochemical detection of protein expression in tumor tissues of mice in each

2.4 RT-qPCR檢測胃癌荷瘤小鼠瘤體組織中基因表達情況

與模型組相比，AG490阻斷劑組和Stattic阻斷劑組小鼠的IL-6、JAK2、STAT3、c-Myc和Cyclin D1 mRNA表達均降低(P<0.01)，見表4。

表4 RT-qPCR檢測各組小鼠瘤體組織中基因表達情況Table 4 RT-qPCR detection of gene expression in tumor tissues of mice in each

2.5 Western blot檢測胃癌荷瘤小鼠瘤體組織中蛋白表達情況

與模型組相比，AG490阻斷劑組和Stattic阻斷劑組小鼠IL-6、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、c-Myc和Cyclin D1蛋白表達均降低，AG490阻斷劑組JAK2蛋白表達降低(P<0.05，P<0.01)，見圖2，表5。

注：A.模型組；B.AG490 阻斷劑組；C.Stattic阻斷劑組Note: A.Model group；B. AG490 blocker group；C.Stattic blocker group圖2 各組小鼠瘤體組織中蛋白表達水平Fig.2 Protein expression levels in tumor tissues of mice in each group

3 討論

胃癌具有較高的發(fā)病率和病死率，嚴重威脅人類健康，尋找胃癌的有效治療靶點顯得至關重要。IL-6參與免疫反應和炎性反應、造血、骨代謝和胚胎發(fā)育，與慢性炎性反應、自身免疫性疾病和癌癥密切相關。IL-6可激活下游相關通路，參與腫瘤細胞的生長[8]。有研究[9]證實JAK2/STAT3信號通路在miRNA-223-3p調控胃癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。胃癌相關成纖維細胞(CAFs)產(chǎn)生IL-6通過激活JAK2/STAT3信號通路，促進胃癌的遷移和上皮間質轉化[10]。

IL-6是活化的T細胞和成纖維細胞產(chǎn)生的淋巴因子，可通過激活JAK增強胃癌細胞的增殖和侵襲能力[11]，JAK是一種蛋白磷酸酶，其作用底物為STAT蛋白，即信號傳導和轉錄活化因子。目前發(fā)現(xiàn)的JAK家族包括JAK1、JAK2、JAK3和TYK2。STAT激活轉位入核后與特定序列DNA片斷結合，調控相關基因的表達，產(chǎn)生特定的生物學效應。JAK蛋白酪氨酸激酶可在細胞因子受體與相應配體結合后活化，進而激活STATs誘導目的基因表達。JAK/STAT信號通路控制著多種對細胞穩(wěn)態(tài)至關重要的細胞過程，在癌癥進展、炎性反應和自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用。在JAK/STAT亞型中，JAK2/STAT3占主要地位。通常是細胞因子、生長因子或干擾素與其受體結合，誘導其二聚化與受體接近并被磷酸化活化，再交互催化Tyr磷酸化活化，該活化位點可作為信號傳導器和轉錄激活因子(STATs)的對接位點，并通過其SH2結構域與它們結合，結合后形成同源或異源二聚體，轉入細胞核[12]。STAT3的激活，可促進下游多種靶基因,如c-Myc、Cyclin D1的活化，從而調控腫瘤的增殖及凋亡[13]。AG490是一種酪氨酸激酶受體抑制劑，可特異性阻斷JAK2，Stattic是一種非肽類STAT3小分子阻斷劑，可靶向針對其SH2結構域，有效抑制STAT3的激活和核易位。阻斷劑的使用為臨床治療胃癌提供了新的思路，單獨或與其他治療藥物聯(lián)合使用可能成為未來的胃癌治療研究方向。

表5 Western blot檢測各組小鼠瘤體組織中蛋白表達情況Table 5 Western blot detection of protein expression in tumor tissues of mice in each

在本研究中，與模型組相比，AG490阻斷劑組、Stattic阻斷劑組小鼠的瘤體質量顯著下降，血清中IL-6含量下降，且AG490阻斷劑組和Stattic阻斷劑組小鼠瘤體組織中的IL-6、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、c-Myc和Cyclin D1蛋白及基因表達顯著下降，AG490阻斷劑組的JAK2蛋白及基因和Stattic阻斷劑組JAK2基因表達降低，說明IL-6可激活JAK2/STAT3信號通路，阻斷劑通過抑制關鍵蛋白，進而降低下游c-Myc、Cyclin D1基因及蛋白的表達，從而影響胃癌的生長及增殖。本實驗使用JAK2和STAT3阻斷劑，證明該通路在胃癌增殖中的作用，為胃癌臨床治療提供新思路。