王曉菲 嚴(yán) 語 趙 展 何 沐 王璟萱 武軍駐 楊懷潔

(1.三峽大學(xué)人民醫(yī)院，宜昌 443000)(2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢 430060) (3.武漢大學(xué)中南醫(yī)院，武漢 430071)(4.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，武漢 430000)

產(chǎn)后抑郁(postpartum depression,PPD)是產(chǎn)后精神疾病的最常見類型之一，發(fā)病率在7.30%～37.14%[1-2]。產(chǎn)后抑郁患者家庭和社會角色受損，對社會產(chǎn)生不良的影響[3]。該病以患者主觀感受為主，缺乏特異性病理生理指標(biāo)，發(fā)病機(jī)制至今仍尚未明確[4]。對該病的病因研究及藥物研發(fā)依賴于科學(xué)的產(chǎn)后抑郁動物模型。

目前產(chǎn)后抑郁動物模型主要有三類：(1)應(yīng)激所致產(chǎn)后抑郁模型:在母鼠妊娠或產(chǎn)后，使母鼠遭受社會刺激(多次雄性入侵)、母仔分離、母體免疫激活或其他刺激(電擊、禁食、束縛等)，顯示出抑郁樣行為，該模型能較真實(shí)地模擬女性孕期的部分危險(xiǎn)因素，但受大鼠個(gè)體差異影響，模型不穩(wěn)定，容易出現(xiàn)假陽性[5]；(2)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)后抑郁模型，常見的有FRL(flinders resistant line) 大鼠、WKY(Wistar-Kyoto)大鼠等[6]，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)后抑郁模型相對穩(wěn)定，個(gè)體差異小，但大鼠適應(yīng)力差，價(jià)格昂貴[7]；(3)激素誘導(dǎo)產(chǎn)后抑郁模型，常見有兩種：激素模擬妊娠后激素停撤(the hormone withdrawal after hormone-simulated pregnancy model)和高皮質(zhì)醇誘導(dǎo)。激素誘導(dǎo)模型可以捕獲雌、孕激素波動引起的情緒改變，個(gè)體差異小。其中高皮質(zhì)醇模型需要大鼠為懷孕狀態(tài)，在實(shí)驗(yàn)過程中不好控制與把握，而激素停撤模型采用外源性激素注射模擬妊娠和產(chǎn)后，實(shí)驗(yàn)中更好操作[8]。本研究擬在復(fù)制激素停撤的大鼠產(chǎn)后抑郁模型基礎(chǔ)上，針對實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)而目前已有文獻(xiàn)中未提及的問題進(jìn)行改進(jìn)，以期為產(chǎn)后抑郁癥的基礎(chǔ)研究提供更穩(wěn)定的動物模型建模及可靠的評價(jià)方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物:清潔級Sprague Dawley(SD)雌性大鼠，5～6月齡，體質(zhì)量(200±10)g，共25只。

1.1.2主要試劑與藥品:注射級苯甲酸雌二醇，批準(zhǔn)文號為：獸藥字(2014)070012511；注射級黃體酮，批準(zhǔn)文號為：獸藥字(2014)070011439(均吉林省華牧動物保健品有限公司)。橄欖油，生產(chǎn)批號：N1011A(美侖生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1激素模擬妊娠后激素停撤大鼠產(chǎn)后抑郁模型的建立

1.2.1.1去勢手術(shù)：預(yù)養(yǎng)一周的大鼠隨機(jī)分為2組：正常組(n=10)和實(shí)驗(yàn)組(n=15)。實(shí)驗(yàn)組行去勢手術(shù)。腹腔注射2%戊巴比妥鈉(0.2 mL/100 g)麻醉，左側(cè)位固定于手術(shù)臺。備皮、消毒大鼠脊柱旁開一橫指、肋緣后一橫指處的皮膚。自腰椎沿背部正中線向下切開皮膚，切口為縱行，長約1 cm。圓頭剪鈍性剝離皮膚與肌肉。擴(kuò)張肌肉層，暴露內(nèi)部組織，定位右側(cè)子宮角，用鑷子輕夾住周圍脂肪組織并將其拉出體外，沿子宮角向上找到輸卵管及卵巢，結(jié)扎后摘除，將子宮體送回腹腔，同法摘除對側(cè)卵巢。分別縫合肌肉、皮下脂肪層及表皮。連續(xù)3 d每天注射0.1 mL青霉素預(yù)防感染。術(shù)后將大鼠置于籠中恢復(fù)。正常組不做處理。

1.2.1.2陰道涂片觀察：于去勢手術(shù)后第2天開始對大鼠進(jìn)行陰道沖洗檢查，每日1次，連續(xù)兩個(gè)生理周期(共10 d)。用吸管吸取約100 μL 0.9%氯化鈉溶液，輕吹入大鼠陰道中，反復(fù)吹吸數(shù)次，待0.9%氯化鈉溶液將大鼠陰道內(nèi)分泌物沖下后將0.9%氯化鈉溶液吸回，滴入96孔板中。光鏡下觀察大鼠陰道分泌物的細(xì)胞學(xué)變化，判斷大鼠是否存在動情周期的改變。有周期變化者表示卵巢未切除干凈，大鼠應(yīng)剔除不用。

1.2.1.3雌、孕激素注射：從去勢手術(shù)結(jié)束后第9天開始激素注射模擬大鼠“妊娠”狀態(tài)下的激素分泌。實(shí)驗(yàn)組大鼠每日皮下注射雌二醇注射液0.1 mL (2.5 μg)及黃體酮注射液0.2 mL(4 mg)，連續(xù)注射16 d，之后改為每日注射雌二醇注射液0.1 mL (50 μg)，連續(xù)注射7 d。注射開始后的第24天(即“產(chǎn)后”第2天)停止激素注射。對照組大鼠前16 d每日皮下注射橄欖油0.3 mL，后7 d每日注射橄欖0.1 mL。

1.2.2 激素模擬妊娠后激素停撤大鼠產(chǎn)后抑郁模型評價(jià)

1.2.2.1曠場實(shí)驗(yàn)(open field test,OFT)：實(shí)驗(yàn)采用無蓋敞箱，大小為100 cm×100 cm×40 cm，敞箱四壁、底部均用黑色、不透明材料制成。位于敞箱頂部的攝影機(jī)全程記錄實(shí)驗(yàn)過程。箱底外圍16塊方格設(shè)定為外場，中間9塊方格設(shè)定為內(nèi)場。內(nèi)場中央為開始測試的起點(diǎn)[9]。實(shí)驗(yàn)前先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)使大鼠適應(yīng)敞箱，建模成功后第2、4天正式實(shí)驗(yàn)，每只大鼠每次測試5 min。每只大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束，需清理動物殘留的糞便、尿液和毛發(fā)，箱底和四壁用酒精紗布擦拭干凈，酒精自然風(fēng)干后再進(jìn)行下一只測試[10]。測試結(jié)果采用Smart3.0分析。具體步驟見參考文獻(xiàn)[9]。

1.2.2.2強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(forced swimming test，F(xiàn)ST)：實(shí)驗(yàn)采用透明圓柱燒杯，直徑30 cm，高60 cm，內(nèi)盛溫水深約48 cm，水溫保持在23～25 ℃。實(shí)驗(yàn)時(shí)，操作者將大鼠放入盛有溫水的燒杯內(nèi)，用攝像系統(tǒng)記錄動物5 min 內(nèi)的運(yùn)動狀態(tài)，分析不動狀態(tài)總時(shí)間(不動狀態(tài)是指動物放棄主動掙扎，軀體處于漂浮不扭動狀態(tài))。5 min后撈起大鼠，干凈干紗布擦干大鼠體表的水，還回原來籠中。每只大鼠結(jié)束實(shí)驗(yàn)后均需換水[11-13]。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)在產(chǎn)后的第6、7天進(jìn)行，結(jié)果采用Smart3.0軟件記錄分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠陰道分泌物的變化比較

與正常組相比，實(shí)驗(yàn)組的大鼠沒有動情周期的變化，趨于穩(wěn)定。

2.2 兩組大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)比較

2.2.1曠場實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)組大鼠活動性下降，曠場實(shí)驗(yàn)水平運(yùn)動距離減短，與正常組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組大鼠行為學(xué)檢測比較Table 1 Comparison of behavioral test between two groups of rats

2.2.2強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)組大鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中不動時(shí)間顯著延長，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

3 討論

懷孕、分娩雖屬于生理現(xiàn)象，但孕產(chǎn)婦受體內(nèi)激素的改變?nèi)菀浊榫w波動，產(chǎn)生焦慮，甚至抑郁。罹患產(chǎn)后抑郁，產(chǎn)婦情感淡漠，興趣減少，照顧嬰兒能力下降，嚴(yán)重者甚至產(chǎn)生自殺或殺嬰的意念或行為，對個(gè)人、家庭以及社會影響巨大。由于產(chǎn)后抑郁病因復(fù)雜且尚未明確，對該病的基礎(chǔ)研究和治療藥物的研發(fā)依賴于產(chǎn)后抑郁動物模型。

女性孕晚期雌激素和孕激素逐漸升高，能分別達(dá)到正常月經(jīng)周期水平的約100倍和10倍。分娩后，這些激素在產(chǎn)后3～7 d迅速下降至卵泡期早期水平[14]。激素大幅度波動被認(rèn)為是女性出現(xiàn)產(chǎn)后抑郁的重要因素之一[15-17]。GALEA等[18]建立了激素模擬妊娠后激素停撤誘導(dǎo)的產(chǎn)后抑郁模型。相比較其他建模方式，該模型能更好的模擬產(chǎn)婦妊娠分娩過程激素波動情況，具有更強(qiáng)的針對性和特異性，目前在基礎(chǔ)研究中運(yùn)用較廣[19-21]。但是已有文獻(xiàn)對建模過程、結(jié)果及效果僅略微提及，并未做詳盡的描述[16,19,22]。本研究通過復(fù)制經(jīng)典的產(chǎn)后抑郁大鼠激素停撤模型[18]，探究建模過程中的諸多問題，并通過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)對此模型作出評價(jià)。

3.1 激素模擬妊娠后激素停撤大鼠產(chǎn)后抑郁模型建模過程中實(shí)驗(yàn)方法改進(jìn)

3.1.1麻醉藥物的選擇：目前動物實(shí)驗(yàn)常用的麻醉劑有烏拉坦、戊巴比妥鈉等。使用烏拉坦，大鼠麻醉時(shí)間長，死亡率高達(dá)33.34%，解剖后發(fā)現(xiàn)肺腸淤血脹氣嚴(yán)重，有腐臭氣味，這一結(jié)果與參考文獻(xiàn)[23]報(bào)道的一致，戊巴比妥鈉效果相對較好，極大降低了死亡率。

3.1.2術(shù)后大鼠處理：手術(shù)后大鼠應(yīng)單籠飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)中大鼠同籠喂養(yǎng)致死3例，為麻醉后蘇醒的大鼠撕咬同籠尚未清醒的大鼠所致。

3.1.3去勢手術(shù)結(jié)果評估：既往的研究報(bào)道以結(jié)晶紫及其改良的快速革蘭染色陰道涂片為主[24-25]，但在實(shí)際操作中結(jié)果不甚理想，改用0.9%氯化鈉溶液沖洗后直接在光鏡下觀察，操作簡單效果好。

3.1.4注射油的選擇：預(yù)實(shí)驗(yàn)中我們分別使用了大豆油、橄欖油和芝麻油。實(shí)驗(yàn)顯示芝麻油不易吸收，大豆吸收效果好于橄欖油和芝麻油，但大豆油中含有異黃酮等植物性雌激素，能與雌激素受體結(jié)合誘導(dǎo)產(chǎn)生弱雌激素作用[26]，為避免建模過程中的干擾，選擇橄欖油為注射油，實(shí)驗(yàn)顯示吸收效果優(yōu)于芝麻油。

3.2 激素模擬妊娠后激素停撤大鼠產(chǎn)后抑郁模型建模后行為學(xué)檢測

與普通的抑郁癥類似，產(chǎn)后抑郁模型評價(jià)也需要采用行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，如曠場實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳等。曠場實(shí)驗(yàn)評價(jià)模型動物在新的環(huán)境中自主行為與探究行為。當(dāng)大鼠出現(xiàn)抑郁樣行為學(xué)改變時(shí)，自主性與探究性會相應(yīng)下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，產(chǎn)后抑郁模型組大鼠水平運(yùn)動距離減短，出現(xiàn)抑郁癥狀。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)是評價(jià)動物行為絕望的經(jīng)典方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，產(chǎn)后抑郁模型組大鼠在強(qiáng)迫游泳中不動時(shí)間顯著延長，反映了行為絕望這一典型抑郁癥狀。

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，采用糖水偏好實(shí)驗(yàn)對兩組大鼠進(jìn)行檢測，但并未觀察到兩組大鼠的差異。在既往對抑郁的基礎(chǔ)研究中證實(shí)抑郁大鼠糖水偏好系數(shù)明顯降低[27-28]，可能是兩種抑郁建模方式的區(qū)別，產(chǎn)后抑郁模型主要是激素模擬妊娠后激素停撤導(dǎo)致的抑郁，和慢性應(yīng)激所致抑郁癥狀的病因并不一樣，最終導(dǎo)致大鼠抑郁后的核心表現(xiàn)差異。綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，曠場實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)可以作為檢測指標(biāo)對產(chǎn)后抑郁動物進(jìn)行建模評價(jià)。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)激素停撤產(chǎn)后抑郁大鼠模型行為學(xué)檢測時(shí)間特殊性。預(yù)實(shí)驗(yàn)中我們在建模后第1、2、4周進(jìn)行測驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，第一周大鼠抑郁癥狀顯著，和正常組對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但到第2、4周時(shí)抑郁樣行為已不顯著。激素停撤產(chǎn)后抑郁大鼠的抑郁癥狀可能與激素水平的變化密切相關(guān)，當(dāng)外源性給與的激素停止后，產(chǎn)后抑郁大鼠可能會自愈。本研究認(rèn)為激素模擬妊娠后激素停撤大鼠產(chǎn)后抑郁模型能較好的模擬妊娠、分娩體內(nèi)激素的變化對情緒的影響，適合開展產(chǎn)后抑郁的基礎(chǔ)研究。建議對產(chǎn)后抑郁大鼠行為學(xué)檢測應(yīng)在建模后一周之內(nèi)進(jìn)行[29]。

近年來臨床醫(yī)護(hù)人員對女性產(chǎn)后抑郁日益關(guān)注與重視，建立良好的動物學(xué)模型是開展研究的關(guān)鍵，不斷完善動物模型和行為學(xué)評價(jià)指標(biāo)對于產(chǎn)后抑郁病因與機(jī)制的研究至關(guān)重要，本研究對激素模擬妊娠后激素停撤大鼠產(chǎn)后抑郁模型進(jìn)行了細(xì)節(jié)探討與改良，提高了建模成功率，為進(jìn)一步開展產(chǎn)后抑郁的研究提供借鑒與幫助。