朱喜春 張永興 俞發(fā)榮

(1.甘肅省藥品檢驗研究院，蘭州 730070)(2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室，蘭州 730046) (3.甘肅政法大學(xué)公安分院，蘭州 730070)

人類疾病實驗動物模型在生物科學(xué)、醫(yī)藥化學(xué)和生命健康等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[1]，是研究疾病的發(fā)生、發(fā)展和病理機制的有效工具[2]。嚴重聯(lián)合免疫缺乏(severe combined immune deficiency,SCID)小鼠因缺乏腺苷脫氨酶(adenosine deaminase，ADA)導(dǎo)致B細胞、T細胞功能缺失，從而表現(xiàn)出嚴重的聯(lián)合免疫缺陷癥狀。SCID小鼠是繼裸鼠(免疫缺陷動物、先天無胸腺和缺乏T淋巴細胞)出現(xiàn)之后，人類發(fā)現(xiàn)的又一種十分有價值的免疫缺陷動物。SCID小鼠已應(yīng)用于人類免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、生理學(xué)、藥理學(xué)等方面的研究，能接受人體腫瘤組織的移植，進行人體腫瘤學(xué)方面的實驗研究。研究證明，高等動物乃至人類組織細胞的正常生長受到不同信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的調(diào)控，其中磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號傳導(dǎo)通路與細胞分裂增殖關(guān)系尤為密切[3]。 有研究[4]發(fā)現(xiàn)，細胞生長或抑制受PI3K-Akt信號傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)和控制，PI3K-Akt信號傳導(dǎo)通路在細胞內(nèi)發(fā)揮重要的作用,參與了許多生理和病理活動。體外研究顯示，采用PI3K-Akt信號傳導(dǎo)通路抑制劑可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的耐藥性[5]和提高抗腫瘤藥物的藥效[6],PI3K-Akt信號傳導(dǎo)通路可能是腫瘤治療的潛在靶點[7]。為了探索不飽和脂肪酸對腫瘤增殖的抑制作用及PI3K-Akt信號傳導(dǎo)通路調(diào)控作用機制，將甘肅貓兒眼(euphorbia kansui)不飽和脂肪酸給予荷肝癌組織的SCID小鼠，探索不飽和脂肪酸對肝癌增殖的抑制作用，為不飽和脂肪酸進一步研究開發(fā)和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，為預(yù)防和治療腫瘤探索新的作用靶點，提供新的藥物資源。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：SPF級SCID小鼠50只,雌雄各半，體質(zhì)量 20～22 g，來源中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實驗動物中心【SCXK (甘)2020-0002】。全部實驗在甘肅省藥品檢驗研究院實驗動物實驗室【SYXK (甘)2020-0006】完成。動物實驗通過甘肅省藥品檢驗研究院動物倫理委員會審核批準(zhǔn)(GYJY-2021-006)，對動物實驗進行了科學(xué)合理的設(shè)計,優(yōu)化實驗,遵守“3R”原則。從動物的購買、運輸,動物使用過程中規(guī)范飼養(yǎng)管理,善待動物,規(guī)范實驗操作技術(shù),動物實驗結(jié)束采用安樂死,讓動物在整個實驗過程中享受人文關(guān)懷。

1.1.2肝癌組織：甘肅省腫瘤醫(yī)院腫瘤外科提供。肝癌組織來源：患者男性，56歲，HCC/Ⅲa/T3N0M0，Child-Pugh A/B， PS 0～2。所有患者知情同意。

1.1.3試劑與儀器：不飽和脂肪酸(蘭州大學(xué)天然植物研究所)，甘肅貓兒眼(euphorbia kansui)塊根(中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所); 5-氟尿嘧啶(5-FU)(上海旭東海普藥業(yè)有限公司)；抗癌基因P53、磷酸肌醇3激酶(P13K)、 細胞周期素依賴性激酶抑制因子(P21)、蛋白激酶B(PKB/Akt)試劑盒(上海生物科技開發(fā)公司)。

1.2 方法

1.2.1肝癌組織移植：選取8周齡SPF級SCID小鼠50只，雌雄各半。全部動物在SPF級實驗室獨立送回風(fēng)凈化籠具(individal ventilation cages,IVC)飼育盒內(nèi)飼養(yǎng)，自由飲水進食，人工光照 12 h。實驗室溫度20～22 ℃，IVC內(nèi)溫度 22.2 ℃，濕度55%～65%，適應(yīng)7 d。將手術(shù)切取2 h內(nèi)肝癌組織放入超凈臺中，用Hanks液反復(fù)沖洗，剔去壞死組織和非癌組織后，將瘤組織切成1～2 mm3小塊，用粗針穿刺移植于SCID小鼠右側(cè)腋窩皮下，IVC飼育盒中飼養(yǎng)。

1.2.2荷瘤 SCID 小鼠分組和給藥 ：按照預(yù)實驗方法，待移植瘤長到6～7 mm時，荷肝癌組織的 SCID 小鼠隨機分為5組，每組 10只。根據(jù)人體用藥量和小鼠體表面積換算，計算得出不飽和脂肪酸給藥量為：低、中、高劑量組腹腔注射不飽和脂肪酸50 mg/(kg·d)、100 mg/(kg·d)和200 mg/(kg·d);五氟尿嘧啶(5-FU)組腹腔注射5-FU 100 mg/(kg·d)，模型組腔注射蒸餾水2 mL/(kg·d)，連續(xù)給藥21 d。

1.2.3腫瘤組織檢測分析：末次給藥后次日乙醚吸入無痛麻醉，手術(shù)切開腫瘤周圍皮膚，剝?nèi)∧[瘤組織，用游標(biāo)卡尺測量移植瘤長(a)、寬(b)和高(c),用體積計算公式V=πabc/6[8]計算移植瘤體積，用天平稱移植瘤質(zhì)量，比較腫瘤生長情況。用萬分之一分析天平稱取各組瘤組織500 mg，用勻漿研磨器研磨，以 2 000 r/min 離心 15 min，取上清，用酶標(biāo)儀在 450 nm 波長下測定吸光度(A)。

1.2.4直線回歸方程制作：取標(biāo)準(zhǔn)品 50 μL，加入酶標(biāo)板，用酶標(biāo)儀在 450 nm 波長下測定吸光度(A)。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的吸光度(A)為縱坐標(biāo)，制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SCID小鼠腫瘤模型建立及不飽和脂肪酸對肝癌移植瘤生長的影響

將肝癌組織分別移植于50只SCID小鼠右側(cè)腋窩皮下，肝癌組織生長正常，腫瘤模型建立成功。將不飽和脂肪酸和5-FU給予荷肝癌組織的 SCID 小鼠，第22天比較各組動物移植瘤生長情況，見圖1；不飽和脂肪酸低、中、高劑量組和5-FU組肝癌移植瘤體積和質(zhì)量顯著小于模型組(P<0.01)，不飽和脂肪酸低、中劑量組肝癌移植瘤體積和質(zhì)量與5-FU組無明顯差異(P>0.05)，高劑量組肝癌移植瘤體積和質(zhì)量顯著小于5-FU組(P<0.01)，見表1。

表1 不飽和脂肪酸對肝癌移植瘤生長的影響Table 1 Effect of unsaturated fatty acids on the growth of liver cancer transplanted n=10)

2.2 不飽和脂肪酸對肝癌移植瘤蛋白表達水平的影響

2.2.1不飽和脂肪酸對肝癌移植瘤P53蛋白表達水平的影響：以P53標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程,見圖2。

注: A：正常組；B：不飽和脂肪酸低劑量組；C：不飽和脂肪酸中劑量組；D：不飽和脂肪酸高劑量組；E：5-FU組;F：模型組Note: A： normal group; B：unsaturated fatty acid low dose group; C： unsaturated fatty acids medium dose group;D： unsaturated fatty acid high dose group; E：5-FU group; F：model group圖1 不飽和脂肪酸對肝癌移植瘤生長的影響Fig.1 Effects of unsaturated fatty acids on the growth of liver cancer transplanted tumor

圖2 P53標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程Fig.2 Linear regression equation of P53 standard curve

與模型組相比，不飽和脂肪酸低、中、高劑量組和5-FU組肝癌移植瘤P53蛋白表達水平明顯降低(P<0.05，P<0.01)，不飽和脂肪酸低、中劑量組肝癌移植瘤P53蛋白表達水平與5-FU組無明顯差異(P>0.05)，高劑量組肝癌移植瘤P53蛋白表達水平顯著低于5-FU組(P<0.01)，見圖3。

注：與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01；與5-FU組相比, #P<0.01；Note：Compared with model group, *P<0.05,**P<0.01; Compared with 5-FU group, #P<0.01圖3 不飽和脂肪酸對肝癌移植瘤P53蛋白表達水平的影響Fig.3 Effect of unsaturated fatty acids on expression level of P53 protein in liver cancer transplantation tumor

2.2.2不飽和脂肪酸對肝癌移植瘤P21蛋白表達水平的影響：以P21標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程,見圖4。

圖4 P21標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程Fig.4 Linear regression equation of P21 standard curve

與模型組相比，不飽和脂肪酸低、中、高劑量組和5-FU組肝癌移植瘤P21蛋白表達水平明顯升高(P<0.05，P<0.01)，不飽和脂肪酸低、中劑量組肝癌移植瘤P21蛋白表達水平與5-FU組無明顯差異(P>0.05)，高劑量組肝癌移植瘤P21蛋白表達水平顯著高于5-FU組(P<0.01)，見圖5。

注：與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01；與5-FU組相比, #P<0.01；Note：Compared with model group, *P<0.05,**P<0.01; Compared with 5-FU group, #P<0.01圖5 不飽和脂肪酸對肝癌移植瘤P21蛋白表達水平的影響Fig.5 Effect of unsaturated fatty acids on expression level of P21 protein in liver cancer transplantation tumor

圖6 P13K標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程Fig.6 Linear regression equation of P13K standard curve

2.2.3不飽和脂肪酸對肝癌移植瘤P13K蛋白表達水平的影響：以P13K標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程,見圖6。

與模型組相比，不飽和脂肪酸低、中、高劑量組和5-FU組肝癌移植瘤P13K蛋白表達水平明顯降低(P<0.05，P<0.01)，不飽和脂肪酸低、中劑量組肝癌移植瘤P13K蛋白表達水平與5-FU組無明顯差異(P>0.05)，高劑量組肝癌移植瘤P13K蛋白表達水平顯著低于5-FU組(P<0.01),見圖7。

注：與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01；與5-FU組相比, #P<0.01；Note：Compared with model group, *P<0.05,**P<0.01; Compared with 5-FU group, #P<0.01圖7 不飽和脂肪酸對肝癌移植瘤P13K蛋白表達水平的影響Fig.7 Effect of unsaturated fatty acids on expression level of P13K protein in liver cancer transplantation tumor

2.2.4不飽和脂肪酸對肝癌移植瘤PKB/Akt蛋白表達水平的影響：以PKB/Akt標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程,見圖8。

圖8 PKB/Akt標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程Fig.8 Linear regression equation of PKB/Akt standard curve

與模型組相比，不飽和脂肪酸低、中、高劑量組和5-FU組肝癌移植瘤PKB/Akt蛋白表達水平明顯降低(P<0.05，P<0.01)，不飽和脂肪酸低、中劑量組肝癌移植瘤PKB/Akt蛋白表達水平與5-FU組無明顯差異(P>0.05)，高劑量組肝癌移植瘤PKB/Akt蛋白表達水平顯著低于5-FU組(P<0.01),見圖9。

注：與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01；與5-FU組相比, #P<0.01Note：Compared with model group, *P<0.05,**P<0.01; Compared with 5-FU group, #P<0.01圖9 不飽和脂肪酸對肝癌移植瘤PKB/Akt蛋白表達水平的影響Fig.9 Effect of unsaturated fatty acids on expression level of PKB/Akt protein in liver cancer transplantation tumor

3 討論

嚴重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠已廣泛用于膀胱癌[10]、皮膚瘢痕[11]、食管癌[12]、肝癌[13]、乳腺癌[14]、結(jié)腸癌[15]等疾病發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)防治療的實驗研究。不飽和脂肪酸作為被廣泛研究的免疫營養(yǎng)物質(zhì),不僅在調(diào)節(jié)機體免疫功能、脂質(zhì)代謝等方面有著重要作用,而且在腫瘤預(yù)防和治療方面也有著重要作用。研究表明,不飽和脂肪酸具有誘導(dǎo)多種腫瘤細胞凋亡[16]、抑制腫瘤細胞增殖[17]、轉(zhuǎn)移[18]等作用，并能抑制相關(guān)癌癥基因編碼蛋白表達[19]，調(diào)控信號傳導(dǎo)通路[20]，降低癌細胞的侵襲力[21]，從而起到抗腫瘤的作用[22]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤生長或抑制受PI3K/Akt信號通路的調(diào)節(jié)和控制[23]。PI3K-Akt信號通路在腫瘤血管生成和細胞生長、增殖、新陳代謝、遷移、分化和凋亡過程中起著至關(guān)重要的作用[24]。PI3K-Akt 信號通路被激活時，促進腫瘤細胞增殖[25]，PI3K-Akt 信號通路被抑制時，促進腫瘤細胞凋亡，發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)[26]。在PI3K-Akt信號傳導(dǎo)通路中，p53、p21基因起著重要的調(diào)控作用。在正常生理條件下，體內(nèi)外環(huán)境因子與細胞膜受體結(jié)合，激活p53基因使之表達，P53蛋白與p21基因直接作用調(diào)控P21蛋白的表達[27],促使P21與二磷酸鳥苷(Guanosine diphosphate，GDP)分離而與三磷酸鳥苷 (Guanosine triphosphate, GTP)結(jié)合，形成P21-GTP復(fù)合體，使細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)開放，細胞開始分裂和增殖；P21具有GTP酶活性，可水解GTP為GDP，P21與GDP結(jié)合而失活，使細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)處于關(guān)閉狀態(tài)，調(diào)控正常的細胞分裂增殖。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予荷人肝癌SCID 小鼠不飽和脂肪酸，肝癌移植瘤生長受到抑制；P53、P13K和PKB/Akt水平下調(diào),從而降低P13K-Akt信號通路活性及下游相關(guān)分子的表達，抑制瘤細胞的增殖；P21水平升高,水解GTP為GDP，P21與GDP結(jié)合而失活，關(guān)閉細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)。這與文獻[28-29]結(jié)果一致。實驗結(jié)果提示，在P13K-Akt信號傳導(dǎo)通路中，p21、P53、P13K和PKB/Akt蛋白水平起著主要的調(diào)控作用，可作為臨床腫瘤治療的潛在靶點。