吳連連 秦 瀅 胡安康

(徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，徐州 221004)

癲癇是一種以大腦神經(jīng)元異常放電為特征的常見中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)。癲癇的病理生理機(jī)制還未完全清晰，一般認(rèn)為：腦內(nèi)發(fā)作間放電是癲癇發(fā)作的基礎(chǔ)，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)外離子分布異?？纱龠M(jìn)癇性放電擴(kuò)展，神經(jīng)元回路對癲癇發(fā)作的擴(kuò)展起重要調(diào)節(jié)作用，神經(jīng)元神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制失調(diào)可促進(jìn)癲癇放電的擴(kuò)散[1]。癲癇的發(fā)生是一個(gè)伴隨海馬神經(jīng)炎性反應(yīng)、異常神經(jīng)發(fā)生和認(rèn)知功能減退的動(dòng)態(tài)過程。腦部炎性反應(yīng)的激活，炎性因子的上升已經(jīng)在癲癇患者和癲癇模型大腦中被證實(shí)[2]。因此，神經(jīng)炎性反應(yīng)是治療癲癇及其并發(fā)癥的重要靶點(diǎn)之一，尋求抗感染的方法在一定程度上會(huì)有助于緩解癲癇。姜黃素作為一種應(yīng)用研究廣泛的多酚類提取物，被證明具有抗感染、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用。姜黃素在神經(jīng)炎性疾病、風(fēng)濕性疾病、感染性疾病、惡性腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病中具有較好的治療潛力，具有很高的研究價(jià)值[3]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究姜黃素在紅藻酸(kainic acid, KA)誘導(dǎo)下的癲癇實(shí)驗(yàn)性模型中的作用和機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級C57/BL6雄性小鼠60只，10～12周，體質(zhì)量20～22 g，由徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【許可證號：SCXK(蘇)2020-0011】。在恒溫 20～25 ℃，相對濕度50%～60%、燈光12 h 晝/夜控制的SPF環(huán)境中飼養(yǎng)，小鼠能自由攝食及飲水。

1.2 試劑與儀器

海仁藻酸、姜黃素(均Sigma-Aldrich公司)，兔抗 GFAP抗體、兔抗IBA-1抗體、山羊抗兔IgG H&L (Alexa Fluor? 555)(均Abcam公司)，小鼠抗IL-1β抗體、小鼠抗NLRP3抗體、兔抗caspase1抗體(均Proteintech公司，山羊抗小鼠IgG H&L (IRDye? 800CW)預(yù)吸附二抗、山羊抗兔IgG H&L (IRDye? 680RD)預(yù)吸附二抗(Abcam公司)。

1.3 癲癇模型制備

60只小鼠隨機(jī)分為3組，每組20只。模型組小鼠腹腔注射KA(25 mg/kg)建立癲癇模型，正常組腹腔注射等量的0.9%氯化鈉溶液，姜黃素組小鼠在造模前12 h腹腔注射姜黃素(400 mg/kg)。觀察兩組小鼠行為學(xué)變化，根據(jù)Racine分級標(biāo)準(zhǔn)[2]進(jìn)行評價(jià)。

1.4 免疫熒光染色

小鼠經(jīng)4%多聚甲醛灌注固定，取腦，后固定過夜。經(jīng)30%蔗糖脫水沉糖，行冰凍切片，切片厚20 μm, PBS清洗切片，用10%山羊血清室溫封閉40 min, 滴加一抗，GFAP抗體(1∶1 000)，IBA-1抗體(1∶1 000)。4 ℃孵育過夜。滴加熒光二抗(1∶100)孵育1.5 h，封片并于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.5 Western blot

海馬組織加入適量的蛋白裂解液，勻漿器勻漿，靜置15 min，4 ℃，8 000 r/min×20 min，離心，吸取上清。BCA法測定蛋白濃度，加入相應(yīng)量的4×SDS上樣緩沖液，沸水煮5 min處理蛋白。等量蛋白樣品經(jīng)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)分離后，用半干轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至 NC 膜上。經(jīng) 5%BSA封閉后加入抗體，IL-1β抗體(1∶500)，NLRP3抗體(1∶1 000)，caspase1抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。洗滌后加入相應(yīng)的二抗(IRDyeTM680 CM)標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體(1∶1000；LI-COR)，室溫避光孵育 1 h；洗膜。Odyssey激光成像系統(tǒng)掃描，結(jié)果以圖像處理儀分析處理。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 癲癇發(fā)作程度和易感性比較

根據(jù)Racine分級標(biāo)準(zhǔn)[4]：0級，行為正常；I級，面部肌肉痙攣，表現(xiàn)為眨眼、咀嚼、動(dòng)須運(yùn)動(dòng)等，以及濕狗樣顫動(dòng)；II級，頸部肌肉痙攣，表現(xiàn)為點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)；III級，單側(cè)前肢陣攣；IV級，站立伴有雙前肢陣攣；Ⅴ級，身體失去平衡倒下，四肢持續(xù)抽動(dòng)。姜黃素治療組小鼠癲癇發(fā)作評分顯著低于模型組小鼠，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),治療組的發(fā)作潛伏期顯著長于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),結(jié)果表明姜黃素能顯著降低發(fā)作等級并延長發(fā)作潛伏期，使發(fā)作程度降低，易感性增加，如圖1。

注：與模型組相比， #P<0.05Note：Compared with the model group， #P<0.05 圖1 癲癇發(fā)作Racine等級評分(A)和潛伏期比較Fig.1 Comparison of Racine grade score (A) and latency (B) of

2.2 免疫熒光檢測膠質(zhì)細(xì)胞活化

與正常組比較，模型組海馬CA3區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物IBA-1的表達(dá)增加，陽性細(xì)胞數(shù)顯著增多，細(xì)胞形態(tài)多呈激活狀態(tài)，細(xì)胞胞體增大、突起變短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組相比，姜黃素治療組的GFAP和IBA-1表達(dá)顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),激活狀態(tài)的細(xì)胞減少，表明姜黃素抑制了癲癇海馬膠質(zhì)細(xì)胞激活，有助于抑制炎性反應(yīng)。如圖2～3。

圖2 各組海馬CA3區(qū)GFAP和IBA-1免疫熒光染色比較Fig.2 Comparison of GFAP and IBA-1 immunofluorescence staining in CA3 area of hippocampus in each group

注：與正常組相比，*P<0.01;與模型組相比,#P<0.05Note：Compared with the normal group，*P<0.01； Compared with the model group，#P<0.05圖3 GFAP+和IBA+細(xì)胞數(shù)比較的統(tǒng)計(jì)圖Fig.3 Statistical chart of comparison of GFAP+ and IBA+ cell

2.3 Western blot檢測IL-1β、NLRP3、caspase1蛋白表達(dá)水平

模型組海馬IL-1β、NLRP3、caspase1蛋白的相對表達(dá)量顯著高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，姜黃素治療組IL-1β、NLRP3、caspase1蛋白的相對表達(dá)量顯著低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖4)。

注：與正常組相比，*P<0.01;與模型組相比,#P<0.01Note：Compared with the normal group, *P<0.01;compared with the model group,#P<0.01圖4 Western blot檢測各組海馬IL-1β、NLRP3、caspase1蛋白的表達(dá)Fig.4 Western blot deteced expression of hippocampal IL-1β, NLRP3,

3 討論

神經(jīng)炎性反應(yīng)是一種由腦外傷、腦腫瘤、癲癇等損傷后產(chǎn)生的內(nèi)在的大腦反應(yīng)。對耐藥局灶性癲癇患者手術(shù)切除的癲癇灶的免疫組織學(xué)和生化研究表明，多種炎性反應(yīng)途徑被激活[5]。在實(shí)驗(yàn)性癲癇模型中，也發(fā)現(xiàn)不同的炎性分子和途徑參與了癲癇發(fā)作的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展[6]。癲癇腦損傷后的神經(jīng)炎性反應(yīng)涉及由激活的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和血腦屏障的細(xì)胞成分產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子的釋放[7-9]。這一事件與炎性介質(zhì)受體的誘導(dǎo)有關(guān)，隨之激活靶細(xì)胞，如膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞中相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號通路[10]。據(jù)報(bào)道，IL-1R1信號通路的內(nèi)源性配體IL-1β的激活在癲癇神經(jīng)炎性反應(yīng)的產(chǎn)生中至關(guān)重要[11]。成熟的、功能性的IL-1β通過caspase-1依賴的方式被NLRP3炎性小體加工和釋放[12]。因此，NLRP3炎性小體介導(dǎo)IL-1β的釋放可能參與癲癇發(fā)作及癲癇形成。有實(shí)驗(yàn)表明在慢性自發(fā)性癲癇形成過程中，NLRP3、caspase-1在大鼠模型海馬齒狀回中表達(dá)升高，可能與炎性反應(yīng)激活有關(guān)[13]。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，炎性反應(yīng)與癲癇的發(fā)作及復(fù)發(fā)密切相關(guān)。神經(jīng)炎性介質(zhì)可通過激活腦細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯后機(jī)制改變神經(jīng)元、膠質(zhì)和血腦屏障功能。如果沒有得到充分控制，神經(jīng)炎性反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致癲癇發(fā)作、神經(jīng)元細(xì)胞丟失、突觸可塑性失調(diào)和共病。在癲癇動(dòng)物模型中，靶向抗感染干預(yù)具有抗癲癇的治療作用。初步的臨床研究也表明，一些抗感染藥物對耐藥性癲癇有治療作用，神經(jīng)炎性因子可以作為疾病的生物標(biāo)志物[14]。

姜黃素是一種天然的活性分子，具有抗感染作用。在過去的幾十年里，人們對其抗感染作用的機(jī)制進(jìn)行了廣泛的研究，并確定了許多分子靶點(diǎn)。姜黃素的抗感染靶點(diǎn)包括NF-kB, COX2以及促炎細(xì)胞因子如IL-1、IL-6和TNF-α等[15-17]。以往多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證明，姜黃素可以減少炎性小體的聚集，抑制NLRP3的激活。表明炎性小體可能是姜黃素的另一個(gè)靶點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，姜黃素對小鼠癲癇發(fā)作的抑制作用顯著，表現(xiàn)為癲癇發(fā)作等級評分顯著降低，發(fā)作潛伏期顯著延長。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中，炎性因子主要由小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia)和星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌。海馬CA3有KA的高親和結(jié)合位點(diǎn)，因此是癲癇發(fā)作的易感區(qū)。本研究檢測了CA3區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)和激活狀態(tài)，模型組小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞大量被激活，處于激活的膠質(zhì)細(xì)胞胞體變大，突起變短，表明癲癇模型組海馬產(chǎn)生明顯神經(jīng)炎性反應(yīng)，而姜黃素顯著抑制了這種現(xiàn)象，激活的細(xì)胞數(shù)顯著減少。為了探討神經(jīng)炎性反應(yīng)產(chǎn)生的機(jī)制，本研究檢測海馬caspase-1、NLRP3、IL-1β蛋白表達(dá)，模型組蛋白表達(dá)顯著升高，表明NLRP3/caspase1/IL-1β通路可能參與癲癇形成，而姜黃素顯著抑制了這3個(gè)蛋白的表達(dá)。

綜合以上結(jié)果，姜黃素在小鼠癲癇形成過程中起到了一定的治療作用。本研究推測姜黃素抑制癲癇的過程可能涉及到神經(jīng)炎性反應(yīng)，這可能會(huì)通過NLRP3/caspase1/IL-1β通路來調(diào)控。