夏 偉，宋松林，廉 維，王富猛，何玉友，董雅文

（吉林正業(yè)生物制品股份有限公司，吉林 吉林 132011）

豬瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）屬黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬（Pestivirus）有包膜的正鏈RNA病毒。直徑為40～60nm。CSFV以高熱、高死亡率為主要特征，該病從發(fā)現(xiàn)至今一直困擾著我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。僅疫苗免疫這個環(huán)節(jié)就耗費了大量的人力和物力。豬瘟C株弱毒疫苗在國外被廣泛應(yīng)用，歐美地區(qū)豬群應(yīng)用該疫苗已根除該病。但是，該病毒不引起細(xì)胞病變，且病毒難于培養(yǎng)，特別是豬瘟弱毒疫苗C株在轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)過程中增殖很難，滴度大約在1×105.5TCID50/mL，迄今為止，豬瘟依然是危害我國養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的疫病之一，而且在疫苗生產(chǎn)中也經(jīng)常出現(xiàn)病毒毒價不穩(wěn)定等問題。為了建立穩(wěn)定生產(chǎn)豬瘟病毒的生產(chǎn)工藝，本試驗馴化成功了全懸浮ST細(xì)胞，建立了無血清高效培養(yǎng)豬瘟病毒方法，為大規(guī)模穩(wěn)定生產(chǎn)CSFV奠定了堅實基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病毒和細(xì)胞 豬瘟病毒C株由吉林正業(yè)生物制品股份有限公司保存；ST細(xì)胞由上海源培生物科技股份有限公司馴化和保存。

1.1.2 豬瘟陰、陽性血清 豬瘟病毒陰、陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 方法

1.2.1 CSFV的IPMA檢測方法建立 將收獲的CSFV病毒培養(yǎng)物按10倍系列稀釋，接種ST細(xì)胞，培養(yǎng)72h，去掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS緩沖液進行洗滌3次，利用冰凍甲醇進行固定20min，棄掉甲醇溶液，用PBS緩沖液進行洗滌3次，進行毒價測定。

（1）浸板：每孔注入200μL的洗滌液，置室溫浸洗一次，輕輕甩出洗液，吸水紙上輕叩。

（2）與血清抗體反應(yīng)：將100倍稀釋的豬瘟陽性血清，加入96孔板中，繞后反應(yīng)板置入濕盒內(nèi)，于37℃溫箱中孵育1h。

（3）洗板：每孔注入200μL洗滌液，立即排除洗液，吸水紙上輕叩，重復(fù)3次。

（4）與酶標(biāo)抗體反應(yīng)：每孔注入100μL稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體，將反應(yīng)板置入濕盒內(nèi)，于37℃溫箱中孵育1h。

（5）洗板：：每孔注入200μL洗滌液，立即排除洗液，吸水紙上輕叩，重復(fù)3次。

（6）底物顯色：每孔注入100μL底物顯色液（現(xiàn)用現(xiàn)配），于室溫反應(yīng)30min。

（7）終止反應(yīng)：甩出反應(yīng)液，每孔注入100μL蒸餾水沖洗一次，干燥。

（8）在顯微鏡下觀察各孔顯色情況，進行樣品結(jié)果判定。

（9）CSFV陽性血清與病毒感染細(xì)胞染色后呈棕紅色。

（10）CSFV陰性血清與抗原感染細(xì)胞無著色反應(yīng)判定為陰性。

大多數(shù)人都在度假時想要去別處，包括那些自小生活在旅游勝地的人。英國人最喜歡的度假地是西班牙，因此5月和8月的公眾假期，英國人會一下擠滿西班牙的城市和海灘。在街上走半天，聽見的凈是英語。英國人會把家庭聚會或者告別單身的狂歡派對都搬去西班牙，狂呼痛飲，跟在英國凄風(fēng)冷雨中那些死樣活氣一錐子扎不出一聲來的英國人非常不同。人在異國，不必顧及面子。我的西班牙同事打算與眾不同一下，在公眾假期選擇去都柏林?；貋硪院笪覇査及亓衷趺礃?，她說：“玩得很愉快，對城市印象很好，都柏林的吉尼斯啤酒比別處的都好喝。美中不足的是大街小巷都是西班牙人?！?/p>

1.2.2 ST細(xì)胞的全懸浮培養(yǎng)

1.2.2.1 細(xì)胞初始接種密度的優(yōu)化 將ST細(xì)胞濃度以20×103/mL、40×104/mL、60×104/mL、80×104/mL和100×104/mL，分別在生物反應(yīng)器中進行培養(yǎng)，每隔24h取樣進行細(xì)胞計數(shù)，活力檢測。

1.2.2.2 補液方式的優(yōu)化 分別采用半換液和逐步加液的方式在生物反應(yīng)器中進行培養(yǎng)，每隔24h取樣進行細(xì)胞計數(shù)，活力檢測，觀察ST細(xì)胞的生長狀態(tài)，選擇最佳的補液方式。

1.2.2.3 攪拌轉(zhuǎn)速選擇 分別選擇60、80、90、100、120r/min的轉(zhuǎn)速在生物反應(yīng)器中進行培養(yǎng)，每隔24h取樣進行細(xì)胞計數(shù)、活力檢測，觀察ST細(xì)胞的生長狀態(tài)，選擇最適攪拌轉(zhuǎn)速。

1.2.3 豬瘟病毒C株懸浮培養(yǎng)參數(shù)確定

1.2.3.1 接毒劑量的優(yōu)化 按照1%、2%、5%、7.5%和10%的接毒劑量，細(xì)胞濃度為50×104/mL的條件下進行培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞的狀態(tài)，細(xì)胞計數(shù)和活力檢測，在接毒后120h收獲，并測病毒TCID50。確定最佳接毒劑量。

1.2.3.2 細(xì)胞濃度的優(yōu)化 細(xì)胞濃度分別確定為20×103/mL、40×104/mL、60×104/mL、80×104/mL和100×104/mL，同步接種5%豬瘟病毒，在生物反應(yīng)器中進行培養(yǎng)，每隔24h取樣進行細(xì)胞計數(shù)，活力檢測，觀察ST細(xì)胞的生長狀態(tài)，在接毒后120h同時收獲病毒，測病毒TCID50。確定最佳細(xì)胞濃度。

2 結(jié)果

2.1 CSFV的IPMA檢測方法檢測結(jié)果將收獲的CSFV病毒培養(yǎng)物按10倍系列稀釋，接種ST細(xì)胞，培養(yǎng)72h，去掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS緩沖液進行洗滌3次，利用冰凍甲醇進行固定20min，棄掉甲醇溶液，用PBS緩沖液進行洗滌3次，進行染色結(jié)果表明，CSFV陽性血清孔染出棕紅色細(xì)胞，CSFV陰性血清孔未染出棕紅色細(xì)胞，如圖1所示，因此本試驗建立的檢測CSFV病毒的IPMA方法可以用于CSFV毒價測定。

圖1 CSFV染色陽性

CSFV染色陰性

2.2 細(xì)胞初始接種密度的優(yōu)化將ST細(xì)胞接種密度以20×103/mL、40×104/mL、60×104/mL、80×104/mL和100×104/mL，分別在生物反應(yīng)器內(nèi)進行全懸浮培養(yǎng)（見表1），結(jié)果表明，隨著ST細(xì)胞培養(yǎng)時間延長，當(dāng)細(xì)胞濃度達到1.0×107/mL以上時，細(xì)胞的生長速度顯著變慢，且處于一個平臺期不再生長，當(dāng)細(xì)胞生長到1.0×107/mL以上時即使提高接種濃度細(xì)胞也處于停滯生長狀態(tài)。

表1 不同ST細(xì)胞濃度對細(xì)胞生長的影響

2.3 補液方式的確定將ST細(xì)胞接種密度調(diào)整為40×104/mL開始在生物反應(yīng)器中進行培養(yǎng)，分別在細(xì)胞培養(yǎng)到48h和72h時進行半換液和逐步加液的方式進行比較發(fā)現(xiàn)，在生物反應(yīng)器中，分別在于48h和72h時更換50%培養(yǎng)基和逐步加液的方式，均可獲得較高的細(xì)胞密度，也避免了營養(yǎng)成分過低和細(xì)胞代謝產(chǎn)物濃度過高對細(xì)胞生長的抑制作用，逐步加液的方式更有利于在生產(chǎn)實踐中廣泛應(yīng)用。

2.4 攪拌轉(zhuǎn)速確定將ST細(xì)胞接種密度調(diào)整為40×104/mL開始在生物反應(yīng)器中進行培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速分別 定 為60、80、100、120、150r/min，結(jié) 果 表 明，120r/min的轉(zhuǎn)速對細(xì)胞生長影響小，培養(yǎng)3d細(xì)胞生長密度可達到620×104/mL，因此，120r/min為最適攪拌轉(zhuǎn)速（見表2）。

表2 不同轉(zhuǎn)速對ST細(xì)胞生長的影響

2.5 細(xì)胞濃度的確定細(xì)胞濃度分別確定為20×103/mL、40×104/mL、60×104/mL、80×104/mL和100×104/mL，同步接種5%豬瘟病毒C株，在生物反應(yīng)器中進行培養(yǎng)，在接毒后120h收獲病毒，結(jié)果表明，細(xì)胞濃度在40×104/mL和60×104/mL時，豬瘟病毒C株病毒滴度可分別達到107.5TCID50/mL和107.2TCID50/mL即最佳細(xì)胞培養(yǎng)濃度為40～60×104/mL時，豬瘟病毒毒價最高（見表3）。

表3 不同ST細(xì)胞濃度對豬瘟病毒C株增殖的影響

2.6 接毒劑量的確定按照1%、2%、5%、7.5%和10%的接毒劑量，細(xì)胞濃度為40×104/mL的條件下進行培養(yǎng)，結(jié)果表明，5%、7.5%和10%的接毒劑量均能達到107.1～107.2TCID50/mL（見表4）。

表4 不同濃度豬瘟病毒C株接種劑量對豬瘟病毒增殖的影響

2.7 收毒時間的確定ST細(xì)胞濃度確定為40×104/mL，同步5%劑量接毒，在生物反應(yīng)器中進行培養(yǎng)，在接毒后24h、48h、72h、96h和120h分別收獲病毒，結(jié)果表明，120h收獲的病毒滴度可達到107.1TCID50/mL。確定最佳收毒時間為120h（見表5）。

表5 不同收毒時間對豬瘟病毒增殖的影響

3 討論

目前豬瘟病毒的生產(chǎn)主要采用原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞培養(yǎng)，但是病毒在細(xì)胞上的繁殖能力不強，直接影響病毒的最終滴度。豬瘟病毒在ST細(xì)胞內(nèi)復(fù)制過程中，病毒滴度低是制約豬瘟病毒弱毒疫苗質(zhì)量不穩(wěn)定的主要原因，豬瘟病毒受到諸多因素的制約，難于繁殖，在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，牛血清中常常含有BVDV抗體，對豬瘟病毒具有較強的中和作用，不利于豬瘟病毒在ST細(xì)胞上復(fù)制，現(xiàn)在豬瘟病毒疫苗半成品生產(chǎn)也有應(yīng)用微載體培養(yǎng)的報道，但是該方法應(yīng)用的微載體小球價格昂貴，工藝不好控制，批間差異大，重復(fù)效果不好，細(xì)胞需求量大。并且還有牛血清成分，對豬瘟病毒培養(yǎng)都是不利的。為了解決這個問題，本研究采用全懸浮ST細(xì)胞無血清培養(yǎng)基高效培養(yǎng)豬瘟病毒，取代了傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶和微載體培養(yǎng)工藝，避免了牛血清對豬瘟病毒繁殖的影響，提高了豬瘟病毒的滴度，解決了豬瘟病毒難于生產(chǎn)的瓶頸問題，同時該工藝也能節(jié)約人力資源，減小豬瘟疫苗生產(chǎn)利用轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)批間差異大的劣勢，為相關(guān)豬瘟病毒多聯(lián)疫苗的研究奠定了堅實基礎(chǔ)，同時該工藝生產(chǎn)的豬瘟病毒弱毒疫苗，減少疫苗的用量，降低了豬群的應(yīng)激，大大提高了豬群的生產(chǎn)性能。