賴寶春，戴瑞卿，曾天寶，姚錦愛

（1.福建省漳州市農(nóng)業(yè)科學研究所，漳州 363005；2.福建省作物有害生物監(jiān)測與治理重點實驗室/福建省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，福州 350013）

鏈霉菌是數(shù)量和種類較多的一類高等放線菌，能產(chǎn)生各種具有生物活性物質(zhì)的次級代謝產(chǎn)物，廣泛分布于土壤和海洋中，在植物體內(nèi)、空氣中也能發(fā)現(xiàn)，在植物病害的防治中起到很重要的作用[1-4]。鏈霉菌的次生代謝產(chǎn)物能產(chǎn)生多種抗生素，種類繁多，在已發(fā)現(xiàn)具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物中占三分之一[5]。目前國內(nèi)外對鏈霉菌的研究多集中在代謝產(chǎn)物方面，而發(fā)酵是鏈霉菌獲取大量有效活性物質(zhì)的必要途徑[6]。因此，在得到高效生防菌后，通過對發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行優(yōu)化是提高生防菌有效活性物質(zhì)產(chǎn)量不可或缺的一部分[7]，對植物病害的生物防治意義重大。大量研究表明，鏈霉菌發(fā)酵液通過優(yōu)化得到最適的發(fā)酵培養(yǎng)基及最佳的培養(yǎng)條件后抑菌活性顯著提高[8-10]。此外，生防制劑的研發(fā)除了考慮抗菌效果外，還要考慮其活性成分的穩(wěn)定性、生產(chǎn)和貯運等問題。

小串鏈霉菌XG40為本實驗室從土壤中分離的一株優(yōu)良拮抗菌，其發(fā)酵液對蜜柚黑斑病菌、番茄葉霉病菌、蜜柚炭疽病菌等植物病原真菌具有明顯的抑制作用，且對植物病原細菌也有較好的抑制作用，盆栽試驗及田間試驗表明，小串鏈霉菌XG40對蜜柚黑斑病、蜜柚炭疽病、蜜柚黑點病均有較好的防控效果，其中對蜜柚黑斑病的防控效果最好[11,12]。前人對小串鏈霉菌的研究多集中在醫(yī)藥、生物及化學領域方面。許多研究報道，小串鏈霉菌能產(chǎn)生仲丁酸[13]、甘氨酸[14]、纖維抑制素[15-16]及生育酚[17]等次生代謝產(chǎn)物，還具有合成銀納米顆粒的潛力[18,19]。但在防治植物病害方面研究較少，國內(nèi)僅蔣常德等[20]報道將小串鏈霉菌與其它微生物制成復合微生物菌肥能防治小麥全蝕病。國外僅Hoda 等[21]報道從土壤中篩選到一株小串鏈霉菌具有促進植株生長及耐受重金屬的能力，且在植株根際定殖能力強。此外，有研究者發(fā)現(xiàn)小串鏈霉菌還能用于防治蟲害，Soliman等[22]從小串鏈霉菌MY12的次生代謝產(chǎn)物中提取的純物質(zhì)能抑制大蠟螟幼蟲發(fā)育、延長幼蟲化蛹期及減少成蟲羽化率。因此，小串鏈霉菌能產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，不同來源的小串鏈霉菌菌種其代謝產(chǎn)物也不盡相同。目前未見小串鏈霉菌發(fā)酵條件優(yōu)化及其活性物質(zhì)穩(wěn)定性的報道。小串鏈霉菌XG40發(fā)酵上清液中含有抗菌的活性物質(zhì)，為進一步提高其活性物質(zhì)的產(chǎn)量，本研究通過對小串鏈霉菌XG40液體發(fā)酵培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，同時對提取物的活性成分穩(wěn)定性進行測定，為后期小串鏈霉菌XG40規(guī)模化發(fā)酵、提純及制劑開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及培養(yǎng)基

小串鏈霉菌Streptomyces catenulaeXG40，琯溪蜜柚黑斑病菌（亞洲柑橘葉點霉Phyllosticta citriasiana），均由漳州市農(nóng)業(yè)科學研究所分離純化并保存。生物測定的培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），高氏1號培養(yǎng)基。發(fā)酵基礎無機鹽培養(yǎng)基：NaCl 0.5 g、K2HPO40.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、FeSO4.7H2O 0.01 g、水1000 mL，pH 7.0；碳、氮源按試驗要求加入，上述培養(yǎng)基均在121 ℃滅菌30 min，備用。

1.2 種子液的制備

將小串鏈霉菌XG40于高氏1號培養(yǎng)基均勻劃線后，28 ℃培養(yǎng)7 d至培養(yǎng)基表面出現(xiàn)淺紫羅蘭色孢子絲。挑取直徑為5 mm的菌餅5塊接入高氏一號液體培養(yǎng)基（250 mL三角瓶裝液量50 mL），于28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，即得種子液。然后以10%（體積分數(shù)，下同）的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中（500 mL三角瓶裝液量100 mL），相同條件下培養(yǎng)7 d。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.3.1 碳源優(yōu)化 在發(fā)酵基礎無機鹽培養(yǎng)基中加入10 g/L蛋白胨及50 g/L不同的碳源（可溶性淀粉、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖和玉米粉），28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，測定菌濃度及抑菌帶的大小。菌濃度的測定[23]：取10 mL發(fā)酵液，6000 r/min離心10 min，棄上清液稱濕菌體質(zhì)量，換算出1000 mL發(fā)酵液里所含的菌體濕質(zhì)量（g），用質(zhì)量濃度表示菌濃度（g/L）。抑菌帶的測定：采用平板對峙培養(yǎng)法[24]。將指示菌（琯溪蜜柚黑斑病菌）接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的中心，在距指示菌25 mm處的2個點打孔，然后在孔中加入200 μL的上清液，對照組中加入相應的培養(yǎng)液，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，待對照組菌絲長至打孔位置后測量抑菌帶寬。

1.3.2 氮源優(yōu)化 在發(fā)酵基礎無機鹽培養(yǎng)基中加入已確定的合適碳源及10 g/L不同的氮源（蛋白胨、酵母粉、黃豆粉、KNO3、(NH4)2SO4和 NH4Cl），28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，測定菌濃度及抑菌帶寬。

1.3.3 正交試驗 利用正交法[23]設計二因素四水平的正交試驗，把已確定的合適碳源、氮源以濃度梯度分別加入到發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中，發(fā)酵7 d，測定菌濃度及抑菌帶寬。

1.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.4.1 初始pH值優(yōu)化 將發(fā)酵液的初始pH值分別調(diào)節(jié)為4.0～10.0，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，確定最適pH。

1.4.2 發(fā)酵溫度優(yōu)化 將發(fā)酵液分別于22 ℃、25 ℃、28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)7 d，確定最佳發(fā)酵溫度。

1.4.3 發(fā)酵時間優(yōu)化 將發(fā)酵液分別培養(yǎng)3～10 d，每天分別取樣，確定最佳發(fā)酵時間。

1.4.4 裝液量優(yōu)化 在500 mL三角瓶中分別裝入50、75、100、125、150、175、200 mL的優(yōu)化培養(yǎng)基，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，確定最適裝液量。

1.4.5 接種量優(yōu)化 將種子液按3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%的接種量接入優(yōu)化后的培養(yǎng)基，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，確定最適接種量。

1.4.6 轉(zhuǎn)速優(yōu)化 設置搖床轉(zhuǎn)速為120、140、160、180、200、220、240 r/min，確定最佳培養(yǎng)轉(zhuǎn)速。以上每組處理重復3次。

1.5 粗提物的制備

選取乙酸乙酯作為提取溶劑，從小串鏈霉菌發(fā)酵液中提取活性物質(zhì)。將10 L無菌發(fā)酵液與10 L的提取溶劑混合，超聲波提取10 min，150 r/min振蕩培養(yǎng)10 min，靜置12 h，使混合液分層，用分液漏斗收集提取后的有機相，在40 ℃條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾至干燥，得到活性成分粗提物，稱重后用一定體積的甲醇溶解，稀釋成 10%、20%、30%、40%、50%的甲醇溶解液。以琯溪蜜柚黑斑病菌為指示菌測定其抑菌活性，測定方法同1.3.1。

1.6 活性物質(zhì)的穩(wěn)定性測定

1.6.1 酸堿穩(wěn)定性 將乙酸乙酯提取物稱重，稀釋成50%的甲醇溶解液，用于下列試驗。調(diào)節(jié)pH值為4.0～10.0，4 ℃冰箱放置24 h后回調(diào)pH值為7.0，以未經(jīng)調(diào)節(jié)pH值的乙酸乙酯提取物溶液為對照。

1.6.2 熱穩(wěn)定性 將乙酸乙酯提取物溶液分別在50 ℃、60 ℃、70℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃的水浴鍋中處理1 h后放至室溫，以未經(jīng)熱處理的乙酸乙酯提取物溶液為對照。

1.6.3 光照穩(wěn)定性 將10 mL乙酸乙酯提取物溶液分別平鋪于無菌培養(yǎng)皿（d=60 mm）底部，在30 W紫外燈下30 cm處分別照射3、6、9、12、15、18 h，以未經(jīng)照射的乙酸乙酯提取物溶液為對照。

1.6.4 貯存穩(wěn)定性 測定乙酸乙酯提取物在液體狀態(tài)下貯存抑菌活性的穩(wěn)定性。將乙酸乙酯提取物溶液分裝至滅菌的離心管中（5 mL大小，每管裝2 mL）。分別置于-20 ℃、4 ℃、20 ℃、28 ℃和37 ℃下存放，在放置0、15、30、60、120 d后，測定其抑菌活性。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行差異性分析，計算平均值和標準差，用Graphpad Prism 8軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對菌絲體生長及產(chǎn)活性物質(zhì)的影響

不同碳源處理的培養(yǎng)基中，玉米粉和葡萄糖有利于小串鏈霉菌XG40菌絲的生長，菌濃度分別為126.59和101.97 g/L，顯著高于其他處理（P＜0.05）；玉米粉作為碳源時的抑菌活性最大，抑菌帶寬為17.3 mm，顯著高于以葡萄糖作為碳源的處理（P＜0.05），更有利于小串鏈霉菌XG40代謝產(chǎn)生活性物質(zhì)（表1）。因此，綜合抑菌活性、菌濃度、材料價格及來源考慮，選用玉米粉作為最佳碳源進行后續(xù)試驗。

表1 不同碳源對小串鏈霉菌XG40菌濃度及產(chǎn)活性物質(zhì)量的影響Table 1 Effect of different carbon sources on the accumulation of mycelium and antibacterial substance of S.catenulae XG40

2.2 不同氮源對菌絲體生長及產(chǎn)活性物質(zhì)的影響

表2結(jié)果表明，小串鏈霉菌XG40在6種不同的氮源培養(yǎng)基中發(fā)酵情況不同，有機氮源中酵母粉和黃豆粉發(fā)酵獲得的菌濃度較多，分別為166.12和191.03 g/L，但酵母粉和黃豆粉產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)的量與菌絲體生長量的變化不一致，抑菌帶寬分別為19.1和18.7 mm，顯著高于其他處理（P＜0.05）；小串鏈霉菌XG40在無機氮源中生長及產(chǎn)生活性物質(zhì)的能力均比有機氮源弱，不適合作為單獨的氮源使用（表2）。綜合考慮，選用酵母粉和黃豆粉作為最佳組合進行后續(xù)試驗。

表2 不同氮源對小串鏈霉菌XG40菌濃度及產(chǎn)活性物質(zhì)量的影響Table 2 Effect of different nitrogen sources on the accumulation of mycelium and antibacterial substance of S.catenulae XG40

2.3 不同氮源比例對菌絲體生長及產(chǎn)活性物質(zhì)的影響

不同比例的黃豆粉和酵母粉替代初始培養(yǎng)基中的氮源對菌絲生長及產(chǎn)活性物質(zhì)的影響結(jié)果表明，隨著黃豆粉和酵母粉比例中黃豆粉比例的降低，菌絲體生長量隨之減少。黃豆粉與酵母粉比例為3:2和2:3時抑菌活性最好，抑菌帶寬分別為19.7和19.6 mm，無顯著性差異（P＜0.05），但黃豆粉、酵母粉比例為3:2時菌濃度和抑菌活性稍優(yōu)于黃豆粉、酵母粉比例為2:3的組合（表3）。因此，選擇黃豆粉、酵母粉比例為3:2組合進行后續(xù)正交試驗。

表3 不同氮源比例對小串鏈霉菌XG40菌濃度及產(chǎn)活性物質(zhì)量的影響Table 3 Effect of different nitrogen sources rate on the accumulation of mycelium and antibacterial substance of S.catenulae XG40

2.4 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇玉米粉作為碳源，黃豆粉、酵母粉比例為3:2作為氮源組合，設計A、B兩因素四水平L16（42）的正交試驗，因素水平和試驗結(jié)果見表4和表5。表5顯示編號10、11、12、14、15、16組合的試驗結(jié)果較好，其中編號11（組合A3B3）組合的抑菌帶最大（21.7 mm），菌濃度高（223.28 g/L），說明菌絲生長好。確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方：玉米粉50 g/L，黃豆粉9 g/L，酵母粉6 g/L，NaCl 0.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L。

表4 優(yōu)化培養(yǎng)基的L16(42) 正交試驗因素和水平Table 4 The orthogonal experiment factors and level L16(42) of optimal medium

表5 小串鏈霉菌XG40發(fā)酵培養(yǎng)基碳源、氮源正交試驗結(jié)果Table 5 Result of the orthogonal test with carbon sources and nitrogen sources in fermentation medium of S.catenulae XG40

2.5 培養(yǎng)基發(fā)酵條件優(yōu)化

小串鏈霉菌XG40在發(fā)酵初始pH值小于或大于7.0時，菌絲體生長及抑菌活性均受到一定的影響，因此確定該菌株液體發(fā)酵的最適初始pH值為7.0（圖1A）。當培養(yǎng)溫度在25 ℃～31 ℃時，均適合小串鏈霉菌XG40菌絲體生長，當溫度大于37 ℃時，不利于小串鏈霉菌XG40菌絲體生長，菌濃度及抑菌帶寬均較小（圖1B）。小串鏈霉菌XG40在發(fā)酵2 d菌絲體基本不生長，也無活性物質(zhì)分泌；第3 d菌絲體少量生長，有活性物質(zhì)產(chǎn)生；至第6 d菌絲體生長量和活性物質(zhì)量均達到最高（P＜0.05），7 d后的菌絲體生長量和活性物質(zhì)量稍微下降，但不明顯（圖1C）。在500 mL的三角瓶中，不同體積的發(fā)酵液造成的傳質(zhì)阻力及相對空氣量不同，當500 mL三角瓶中的裝液量少于100 mL時，隨著裝液量的增加，菌濃度和抑菌活性也逐漸增加；當裝液量為100 mL時，既能保證小串鏈霉菌XG40菌絲生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，又有利于活性物質(zhì)量的產(chǎn)生；當裝液量大于100 mL時，表現(xiàn)出空氣量變小，氧氣傳質(zhì)阻力變大，不利于菌濃度和活性物質(zhì)的產(chǎn)生（圖 1D）。接種量對小串鏈霉菌 XG40菌絲生長和產(chǎn)生活性物質(zhì)影響顯著，當接種量為7%時，菌濃度和抑菌帶寬最大，分別為286.72 g/L和23.2 mm；隨著接種量的不斷增大，菌濃度開始逐漸減少，當裝液量大于15 %時，菌濃度和抑菌活性下降較快，可能是培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不能滿足菌絲體生長的需要（圖1E）。當轉(zhuǎn)速為120～160 r/min時，小串鏈霉菌XG40的菌濃度逐漸增加；以轉(zhuǎn)速為160 r/min時，菌濃度和抑菌帶寬最大，分別為295.39 g/L和23.3 mm（圖1F）。綜合上述菌濃度和抑菌帶寬2個指標，確定小串鏈霉菌XG40液體發(fā)酵初始最適pH值為7.0，溫度為28 ℃，發(fā)酵時間6 d，裝液量100 mL/500 mL，接種量7%，轉(zhuǎn)速160 r/min。

圖1 不同發(fā)酵條件對小串鏈霉菌XG40菌濃度及活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of different fermentation conditions on mycelium and antibacterial substance of S.catenulae XG40

2.6 發(fā)酵培養(yǎng)基及條件優(yōu)化前后效果對比

通過對培養(yǎng)基碳源、氮源及發(fā)酵條件優(yōu)化后的抑菌帶寬為23.3 mm，顯著高于基礎培養(yǎng)基的抑菌帶寬16.8 mm（P＜0.05），抑菌活性提高了38.7%（圖2），表明發(fā)酵培養(yǎng)基及條件優(yōu)化后更有利于小串鏈霉菌XG40代謝產(chǎn)生活性物質(zhì)。

圖2 小串鏈霉菌XG40發(fā)酵培養(yǎng)基及條件優(yōu)化前后效果對比Fig.2 Comparison effects of S.catenulae XG40 fermentation broth before and after medium and conditions optimization

2.7 粗提物的抑菌活性測定

通過對發(fā)酵液中粗提物的抑菌活性測定結(jié)果表明，乙酸乙酯能把小串鏈霉菌XG40發(fā)酵液中的活性物質(zhì)很好地提取出來，該提取物稀釋為不同濃度的甲醇溶解液，對蜜柚黑斑病的抑菌作用差異顯著（P＜0.05），其中，稀釋為40%、50%甲醇溶解液的抑菌作用顯著高于其他濃度，并隨著活性物質(zhì)濃度的降低，抑菌作用顯著減弱（圖3和4）。

圖3 不同濃度活性物質(zhì)對黑斑病菌菌絲的抑菌效果Fig.3 Antifungal activity of active component concentration gradient against mycelial growth of P.citriasiana

圖4 活性物質(zhì)抑菌活性濃度梯度測定Fig.4 Determination of antifungal activity of active component concentration gradient

2.8 活性物質(zhì)的理化性質(zhì)

在酸堿穩(wěn)定性試驗中，小串鏈霉菌XG40乙酸乙酯提取物分別在pH值為4～10的環(huán)境中能保持良好的抑菌活性，抑菌帶寬均為20.0 mm以上，在pH值為7處理后抑菌帶寬為24.2 mm，隨著酸性和堿性的增強，抑菌活性有所下降，但差異不顯著（P＜0.05）。在pH值為4和pH值為10的條件下抑菌帶寬分別為20.2和20.0 mm，說明小串鏈霉菌XG40的活性物質(zhì)對酸堿較穩(wěn)定（圖5A）。

在熱穩(wěn)定性試驗中，50 ℃處理1 h后，乙酸乙酯提取物的抑菌活性沒有明顯下降。60 ℃處理1 h，抑菌活性有明顯的下降，抑菌帶寬為20.2 mm，與50 ℃的處理差異顯著（P＜0.05）。70 ℃處理1 h的抑菌帶寬下降至15.8 mm，顯著低于60 ℃的處理（P＜0.05）。80 ℃和100 ℃高溫處理1 h后幾乎失去抑菌活性。說明小串鏈霉菌XG40的活性物質(zhì)對60 ℃～70 ℃之間的溫度敏感，對70 ℃以上的高溫比較敏感（圖5B）。

在紫外線照射穩(wěn)定性試驗中，隨著照射時間的延長，乙酸乙酯提取物的抑菌活性下降明顯。在紫外線照射3 h，抑菌帶寬下降至22.8 mm，與對照相比差異顯著（P＜0.05）；照射12 h，抑菌帶寬下降至19.8 mm，顯著低于照射3 h的處理?；钚猿煞衷? h內(nèi)的紫外線照射表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，有利于室外防治與應用（圖5 C）。綜合上述結(jié)果表明，小串鏈霉菌XG40的活性物質(zhì)較耐酸堿和短時間的紫外線照射，對70 ℃以上的高溫比較敏感。

圖5 不同條件對活性成分抑菌活性的影響Fig.5 Effect of different conditions on antifungal actvity of the active component of S.catenulae XG40

在貯存穩(wěn)定性試驗中，將乙酸乙酯提取物溶解在甲醇中進行貯存時，其穩(wěn)定性較好。在-20 ℃貯存120 d時，其抑菌活性未見明顯下降。在4 ℃貯存120 d時，仍保持有較好的抑菌活性，抑菌帶寬為21.1 mm；在20 ℃～37 ℃貯存時，第30 d的抑菌帶寬分別為22.3、21.2和20.8 mm，至第120 d的抑菌帶寬分別下降為20.3、20.2和15.2 mm。乙酸乙酯提取物在甲醇溶解的條件下，貯存在-20 ℃可長期保持良好的抑菌活性，在4 ℃能保持較好的抑菌活性，在室溫（20 ℃～28 ℃）條件下貯存時間不宜超過120 d，在37 ℃條件下貯存時間不宜超過30 d（圖6）。

圖6 溫度和貯存時間對活性成分抑菌活性的影響Fig.6 Effect of Temperature and storage period on antifungal actvity of the active component of S.catenulae XG40

3 討論

鏈霉菌具有產(chǎn)生多種生物活性次生代謝產(chǎn)物的能力，這類次生代謝產(chǎn)物在微生物過渡到穩(wěn)定期或營養(yǎng)條件不足時產(chǎn)生，對人類的生產(chǎn)實踐有重要的影響。微生物發(fā)酵產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物的生物合成過程非常復雜，容易受許多因素的相互影響，如培養(yǎng)基組成與配比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵pH等[25,26]。適宜的培養(yǎng)基配方?jīng)Q定發(fā)酵水平與原料成本的高低，且培養(yǎng)基各成分間存在復雜的交互作用，因此，優(yōu)化微生物培養(yǎng)基的組成尤為重要[27]。本研究綜合考慮抑菌效果、菌絲生長及發(fā)酵成本等前提下，采用單因子和正交試驗相結(jié)合的方法對小串鏈霉菌XG40的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明，緩效碳源玉米粉比速效碳源葡萄糖更有利于小串鏈霉菌XG40的菌絲生長和活性物質(zhì)的產(chǎn)生，黃豆粉和酵母粉組合作為有機氮源其菌絲生長量和活性物質(zhì)產(chǎn)量比無機氮源高，說明有機氮源更適合小串鏈霉菌XG40的發(fā)酵培養(yǎng)，與王明環(huán)等[28]的報道一致。除了優(yōu)化培養(yǎng)基組成之外，菌株的活性物質(zhì)產(chǎn)生還與發(fā)酵培養(yǎng)的初始pH、溫度、時間、裝液量、接種量和轉(zhuǎn)速等條件有關，通過培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化可獲得最佳的生產(chǎn)效率和經(jīng)濟效益[29,30]。同屬不同菌株的鏈霉菌在碳源、氮源利用及發(fā)酵環(huán)境條件方面存在一定差異，如直絲鏈霉菌A8[28]的碳源、氮源為可溶性淀粉30 g/L，黃豆粉6 g/L，酵母膏4 g/L，最佳發(fā)酵條件為pH值7.0～8.0，溫度28 ℃～31 ℃，發(fā)酵時間8 d，裝液量100～200 mL，接種量3%～7 %。而暗黑鏈霉菌PY-1[29]的碳源、氮源為玉米粉50 g/L，葡萄糖5 g/L，蛋白胨5 g/L，最佳發(fā)酵條件為pH值7.0，溫度28 ℃，發(fā)酵時間5 d，裝液量90 mL，接種量5%，轉(zhuǎn)速180 r/min。本研究小串鏈霉菌XG40優(yōu)化后的最佳碳源、氮源為玉米粉50 g/L，黃豆粉9 g/L，酵母粉6 g/L，最佳發(fā)酵條件為pH值7.0，溫度28 ℃，發(fā)酵時間6 d，裝液量100 mL，接種量7%，轉(zhuǎn)速160 r/min。此條件下抑菌帶寬（23.3 mm）是基礎培養(yǎng)基條件下抑菌帶寬（16.8 mm）的1.39倍。上述研究結(jié)果表明小串鏈霉菌XG40與其他鏈霉菌的發(fā)酵培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件不盡相同，原因可能與菌種自身的遺傳特性、生理特征及分離來源有關，也可能與指示菌抑菌活性評價有關，還需進一步探究。此外，不同的無機鹽對微生物的生長及抑菌活性也會產(chǎn)生較大的影響[29]，下一步將針對無機鹽如Na+、K+、Fe+、Mg+等進行優(yōu)化。

生防制劑的開發(fā)不僅要考慮抑菌效果，還要考慮活性物質(zhì)的穩(wěn)定性、生產(chǎn)和存儲等問題?；钚晕镔|(zhì)在應用時易受溫度、光照、濕度等外界環(huán)境條件的影響[7,31]。本研究采用乙酸乙酯對菌株 XG40發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)進行提取，獲得的活性物質(zhì)對琯溪蜜柚黑斑病菌菌絲生長具有很強的抑制作用，說明乙酸乙酯能將發(fā)酵液中的活性物質(zhì)有效的提取出來，與呂昂等[31]報道的一致。放線菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物種類繁多，性質(zhì)不同，其結(jié)構(gòu)與活性、穩(wěn)定性等關系密切[32]。前人對鏈霉菌提取物穩(wěn)定性的研究報道較少。張楠[33]等報道吸水鏈霉菌BS-112產(chǎn)生的活性物質(zhì)對紫外線較為敏感，限制了其進一步的田間應用。王辰[23]等報道白刺鏈霉菌CT205所產(chǎn)生的活性物質(zhì)對酸堿不穩(wěn)定（pH 4-10），對熱（60 ℃、80 ℃和100 ℃分別處理15 min）和紫外光（照射30 min）穩(wěn)定性較強。呂昂等[31]報道鏈霉菌3-10提取物對堿不穩(wěn)定（pH 8～13），對高溫（60 ℃處理60 min抑制率下降至55.3%）和紫外線（照射20 min抑制率下降至9.7%）比較敏感，在甲醇溶解液中貯存穩(wěn)定性較好。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果不盡相同，小串鏈霉菌XG40活性物質(zhì)較耐酸堿（pH 4～10）和短時間（180 min）的紫外線照射，熱穩(wěn)定性良好（60 ℃處理60 min抑制率下降至87.8%），在甲醇溶解液中耐貯性較好，有利于運輸和田間防治。

本研究以琯溪蜜柚黑斑病菌為指示菌，優(yōu)化了小串鏈霉菌XG40的發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件，優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方簡單，易得且成本較低，其活性物質(zhì)較穩(wěn)定、易于貯存，為該菌株的田間應用及進一步研制開發(fā)提供了前期基礎。下一步將對該菌株的活性物質(zhì)進行分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及對防治其他植物病害的篩選等方面進行探究。