司方潔，任金瑤，黃濤祥，俞儀陽，郭堅華，蔣春號

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，南京 210095）

番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌Botrytis cinerea引起的一種重要的世界性番茄病害，嚴(yán)重影響番茄果實的產(chǎn)量和品質(zhì)。該病害造成果實腐爛，也侵染葉、莖和花，造成嚴(yán)重減產(chǎn)，產(chǎn)量損失高達(dá) 20%～50%，而且發(fā)病后傳播速度快，極大的威脅保護(hù)地的番茄安全生產(chǎn)[1]。該病害已在全國各地普遍發(fā)生，且呈上升趨勢，已成為番茄等茄果類蔬菜設(shè)施栽培的主要限制因素[2,3]。另外，由于缺少抗病品種，農(nóng)業(yè)防治措施需要大量人力，化學(xué)防治易產(chǎn)生抗藥性，因此使用芽胞桿菌等生物防治的方式防治灰霉病被認(rèn)為具有廣闊的應(yīng)用前景。

芽胞桿菌可以在生物表面形成生物被膜繼而大量定殖，且生防菌在葉圍、根圍的定殖能力與其防病能力密切相關(guān)[4,5]。芽胞桿菌生物被膜基質(zhì)的組成成分包括胞外多糖（EPS）、TasA蛋白、γ-多聚谷氨酸（γ-PGA）以及一些脫氧核糖核酸（DNA）等物質(zhì)。生物被膜的構(gòu)成骨架和基本組分是通過epsA-O操縱子和tapA-sipW-tasA操縱子合成胞外多糖（EPS）和胞外蛋白TasA，后將其分泌到胞外基質(zhì)，從而維持芽胞桿菌生物被膜的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[6]。在芽胞桿菌生物被膜形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵因子Spo0A下游的SinR/SinI系統(tǒng)中[6,7]，SinR是一種DNA結(jié)合蛋白，可以結(jié)合在epsA-O和tapA-sipW-tasA的啟動子區(qū)域，從而抑制生物被膜的形成[6,7]。sinI位于sinR的下游能夠與sinR結(jié)合，阻礙sinR與啟動子區(qū)域結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)生物被膜的形成。除了 SinR/SinI系統(tǒng)，Spo0A下游還有 AbbA/AbrB系統(tǒng)，AbrB功能與sinR類似，可以抑制epsA-O和tapA-sipW-tasA的表達(dá)，從而抑制生物被膜的形成。然而AbbB與AbrB結(jié)合成為復(fù)合蛋白，能阻礙AbrB與epsA-O和tapA-sipW-tasA的結(jié)合，促進(jìn)生物被膜的表達(dá)[8,9]。除了通過大量定殖在葉圍、根圍表面形成生物被膜從而防治灰霉菌，芽胞桿菌也產(chǎn)生多種具有廣泛生物活性的化合物用于防治番茄病害[10,11]，芽胞桿菌能分泌多種抗生素物質(zhì)，酶類以及一些小肽和蛋白，例如，枯草菌素可以顯著防治小麥全蝕病，并且促進(jìn)小麥的生長，枯草芽胞桿菌分泌的iturin A和fengycin顯著抑制黃瓜白粉病[11]。

課題組前期篩選獲得的一株貝萊斯芽胞桿菌B.velezensis5YN8，其對于灰霉病具有高拮抗活性，溫室試驗結(jié)果顯示，其可以在葉片大量定殖，高效防治灰霉病[10]。眾所周知，生防芽胞桿菌的防病效果受到各種防病相關(guān)性狀的影響，尤其是5YN8在根圍、葉圍的定殖能力影響生防菌株對番茄病害的生防效果，同時定殖情況對番茄的生長促進(jìn)非常重要。而生物被膜的形成可以使5YN8在植物葉部高效定殖、持續(xù)存在并發(fā)揮作用。因此，本文構(gòu)建不同生物被膜調(diào)控系統(tǒng)的突變體，如生物被膜形成相關(guān)基因spo0A、epsA-O、tasA、sinl、sinR、abrB[12]（圖1），并檢測了基本生理生化特性及其防病表型，探究調(diào)控貝萊斯芽胞桿菌5YN8生物被膜的形成機(jī)制，研究生物被膜形成能力與5YN8定殖量、拮抗效果、防效的相關(guān)性，探究5YN8形成生物被膜的能力對于其防治番茄灰霉病的作用。

圖1 芽胞桿菌生物被膜形成基因調(diào)控系統(tǒng)Fig.1 The gene regulation pathway of biofilm formation in Bacillus sp.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試番茄品種：合作903（上海市長征良種實驗場）。

供試菌株：生防菌株貝萊斯芽胞桿菌B.velezensis5YN8[10]，參試病原菌灰霉菌Botrytis cinereaBC1303，均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生物農(nóng)藥及綠色植保實驗室保存。

1.2 生防菌5YN8菌液的制備

貝萊斯芽胞桿菌5YN8保存于-70 ℃超低溫冰箱中，利用LB培養(yǎng)基，采用劃線法活化菌株，LB（胰蛋白胨10 g/L；酵母提取物5 g/L；NaCl 10 g/L，pH調(diào)至7.0）培養(yǎng)基上37 ℃，培養(yǎng)1 d。挑取平板上單個菌落接種于5 mL LB試管培養(yǎng)液中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h后制成種子液。后面根據(jù)實際需求擴(kuò)大培養(yǎng)，條件如上所述。

1.3 生防菌5YN8生物被膜形成關(guān)鍵基因突變體的構(gòu)建

在野生型貝萊斯芽胞桿菌菌株5YN8中構(gòu)建目的基因突變體采用基因組DNA直接轉(zhuǎn)化方法[13]，提取相應(yīng)菌株的基因組（表1），挑取過夜培養(yǎng)野生型貝萊斯芽胞桿菌5YN8單菌落至2 mL MC（每升含K2HPO4，14.036 g；KH2PO4，5.239 g；葡萄糖20 g；300 mmol/L檸檬酸三鈉，10 mL；22 mg/mL檸檬酸鐵銨，1 mL；酪蛋白水解物，1 g；谷氨酸鉀2 g，過濾滅菌）培養(yǎng)液中，在37 ℃振蕩培養(yǎng)6 h后吸取300 μL入新試管中并加入基因組。繼續(xù)培養(yǎng)2 h后將培養(yǎng)液涂布于含有相應(yīng)抗生素的LB 平板上，構(gòu)建了野生型菌株5YN8的生物被膜形成基因突變體spo0A、epsA-O、tasA、sinl、sinR和abrB。

表1 本研究種涉及到的菌株列表Table 1 The strain information used in this study

提取大腸桿菌中含有的pDG1662質(zhì)粒，挑取過夜培養(yǎng)野生型貝萊斯芽胞桿菌5YN8單菌落至2 mL MC培養(yǎng)液中，在37 ℃振蕩培養(yǎng)6 h后吸取300 μL入新試管中并加入pDG1662質(zhì)粒。繼續(xù)培養(yǎng)2 h后將培養(yǎng)液涂布于含有氯霉素的LB 平板上，構(gòu)建具有氯霉素抗性的菌株5YN8。

1.4 生防菌5YN8及其突變體在番茄葉片上的定殖動態(tài)檢測

將5YN8及其突變體ΔepsA-O、ΔsinI、Δspo0A、ΔtasA、ΔsinR和ΔabrB培養(yǎng)至OD600值為1.0，將不同的發(fā)酵菌液分別噴施于清水清洗過的番茄葉片，分別在接種的第0、2、4、6、8和14 d，將0.2g的葉片在1.8 mL的PBS緩沖液中研磨，研磨后的勻漿稀釋涂布于LB平板（5YN8采用氯霉素 5 μg/mL，ΔepsA-O、ΔsinI、Δspo0A、ΔtasA采用壯觀霉素50 μg/mL，ΔsinR、ΔabrB采用卡那霉素50 μg/mL），統(tǒng)計菌落數(shù)。

1.5 生防菌5YN8及其突變體對番茄灰霉病菌的體外拮抗

采用平板對峙法測定貝萊斯芽胞桿菌5YN8野生株和突變株活體對番茄灰霉病害病原菌的抑菌活性：在28 ℃的恒溫?fù)u床中以在200 r/min轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)5YN8至OD600值為1.0為5YN8菌液。在距離5 mm的灰霉菌菌碟2.5 cm處分別點置2 μL的上述5YN8的菌液與ΔepsA-O、ΔsinI、Δspo0A、ΔtasA、ΔsinR、ΔabrB突變體，菌絲長至接近滿皿時測量抑菌帶寬度。

1.6 生防菌5YN8及其突變體對于番茄灰霉病防效測定

取4周大小野生番茄苗，分別用貝萊斯芽胞桿菌5YN8野生型及突變體菌株ΔepsA-O、ΔsinI、Δspo0A、ΔtasA、ΔsinR、ΔabrB、無菌水噴施于番茄葉片表面。3 d后，從3株番茄上剪下共12片葉片，接種直徑3 mm灰霉菌碟，將接種灰霉菌的葉片放在濕紙上，置于覆蓋透明膜的塑料托盤內(nèi)置于20 ℃，相對濕度為90%，光周期為12 h（200 μE/m2s）/12 h的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種2～3 d后用游標(biāo)卡尺測量病斑大小。

1.7 生防菌5YN8及其突變體固氣界面的生物被膜表型檢測

吸取5 μL對數(shù)生長期菌液點于LBGM（胰蛋白胨10 g/L；酵母提取物5 g/L；NaCl 10 g/L，0.1 mmol/L MnSO40.1%，50%甘油2%，pH調(diào)至7.0）平板上，通風(fēng)櫥吹干后置于室溫培養(yǎng)72 h，以尼康COOLPIX相機(jī)拍照記錄菌落形態(tài)。

1.8 生防菌5YN8及其突變體液氣界面的生物被膜表型檢測

吸取3 μL對數(shù)生長期菌液加入含有3 mL LBGM培養(yǎng)液的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。室溫靜置培養(yǎng)24 h，采用尼康COOLPIX拍照，記錄結(jié)果。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用 IBM SPSS 21 軟件 Duncan’s 新復(fù)極差法進(jìn)行統(tǒng)計分析、皮爾遜相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌5YN8及其突變體生物被膜的形成

通過對貝萊斯芽胞桿菌5YN8及其構(gòu)建的突變體進(jìn)行生物被膜表型檢測，如圖2A結(jié)果所示，在24 h時，與野生型相比，突變體在生物被膜形成能力上具有顯著差異。5YN8在培養(yǎng)24 h后能夠形成有空間立體結(jié)構(gòu)且具有褶皺的生物被膜，但在突變體菌株ΔtasA、ΔepsA-O中形成的生物被膜光滑。突變體菌株ΔsinI、Δspo0A形成的生物被膜，與ΔtasA、ΔepsA-O相比，生物量顯著增多，但與野生型相比形成的褶皺不顯著。突變體菌株ΔsinR、ΔabrB中形成的生物被膜具有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，并且形成了豐富的褶皺。如圖2B顯示，在固、氣接觸面上，72 h后生物被膜增強(qiáng)型中間凹陷，環(huán)狀突起褶皺顯著，外圈的褶皺十分顯著。野生型菌株5YN8僅僅出現(xiàn)了內(nèi)部凹陷，外部的褶皺不顯著。突變體菌株ΔsinI、Δspo0A、ΔtasA在培養(yǎng)基表面未形成凹陷，僅中間部分出現(xiàn)褶皺，其中ΔepsA-O甚至未出現(xiàn)褶皺。

圖2 菌株5YN8與突變體的生物被膜形成能力比較Fig.2 The Comparison of biofilm formation ability between biocontrol strain 5YN8 and mutants

2.2 生防菌5YN8及其突變體在番茄葉片表面的定殖情況

如圖3結(jié)果所示，生防菌5YN8的生物被膜形成能力與葉面的定殖能力緊密相關(guān)，0 d初始時5YN8定殖量為5.4×106CFU/g，隨著時間推移5YN8的定殖量逐漸減少；第14 d，定殖量為3.9×105CFU/g。5YN8的突變體ΔepsA-O、ΔsinI、Δspo0A的定殖趨勢一致，生物被膜減弱型突變體在第8 d會顯著下降，最終在葉片的定殖量為6.16×104CFU/g，ΔtasA在第2 d、第6 d定殖量顯著降低，最終定殖量為1.2×105CFU/g，生物被膜增強(qiáng)型突變體ΔsinR、ΔabrB初始定殖量在6×106CFU/g，在第2 d開始相比生物被膜減弱型葉圍定殖量降低速度緩慢，但ΔabrB在第4 d定殖量會增加，逐漸減少后最終定殖量為1.4×106CFU/g。

圖3 菌株5YN8及其突變體在番茄葉片的定殖動態(tài)Fig.3 Colonization dynamics of biocontrol strain 5YN8 and its mutants on tomato leaves

2.3 生防菌5YN8及其突變體的抑菌活性檢測

為探究生物被膜相關(guān)基因的突變對抑菌效果的影響，檢測生防菌5YN8及突變體對灰霉病的抑菌效果（圖4A）結(jié)果表明，5YN8形成生物膜的能力與直接拮抗灰霉病的效果具有一定的相關(guān)性。生物被膜增強(qiáng)型的突變體菌株ΔsinR與ΔabrB，其顯著增強(qiáng)了對灰霉病菌的直接拮抗效果，并且ΔabrB的直接拮抗效果強(qiáng)于生物被膜增強(qiáng)突變體ΔsinR。同時，生物被膜減弱型的抑菌效果顯示，生物被膜減弱型對于灰霉病的拮抗帶寬均不同程度發(fā)生了減少（圖4B）。另外，圖4C的結(jié)果表明，生物膜相關(guān)基因的缺失不影響菌株的生長。通過平板拮抗的抑菌帶寬發(fā)現(xiàn)，生物被膜減弱型ΔepsA-O、ΔsinI、ΔtasA對于灰霉病原菌的拮抗帶寬顯著減少，ΔabrB、ΔsinR對于灰霉病原菌的拮抗帶寬顯著增寬。

圖4 菌株5YN8及其突變體對灰霉病菌的抑菌效果Fig.4 The inhibition effect of biocontrol strain 5YN8 and mutants against B.cinerea

2.4 生防菌5YN8及其突變體對于番茄灰霉病的防治效果

為探究生物被膜相關(guān)基因的突變對其生防效果的影響，在葉片噴施野生型5YN8及其突變體3 d后，接種灰霉菌碟，探究野生型菌株及其突變體的防治效果。如圖5、表2結(jié)果表明，對于生物被膜減弱型突變體ΔtasA、ΔsinI、Δspo0A、ΔepsA-O其對于灰霉病的防治效果減弱，防效僅為43.76%、41.45%、16.02%和25.65%。生物被膜增強(qiáng)型ΔabrB與ΔsinR對于灰霉病的防治效果顯著增強(qiáng)，防治效果達(dá)80.77%、78.94%。結(jié)果表明，生物被膜作為定殖的關(guān)鍵一步對于生防菌的防治效果具有重要作用，增強(qiáng)生物被膜形成能力也顯著增強(qiáng)了生防菌對灰霉病的防治效果。

圖5 菌株5YN8及其突變體在離體葉片上的防治效果Fig.5 The control effect of biocontrol strain 5YN8 and its mutants on detached leaves

表2 菌株5YN8及其突變體對番茄灰霉病的防治效果Table 2 The control effect of biocontrol strain 5YN8 and its mutants on B.cinerea

2.5 皮爾遜相關(guān)性分析

對生防菌定殖能力、抑菌帶寬與病斑直徑（病害嚴(yán)重度）之間的相關(guān)性進(jìn)行分析結(jié)果顯示，生防菌定殖能力與病斑直徑的R=-0.9725，抑菌帶寬與病斑直徑的R=-0.8708，說明兩者之間呈線性相關(guān)。從圖 6可以看出，生防菌定殖能力與病斑直徑（病害嚴(yán)重度）之間呈負(fù)相關(guān)，生防菌定殖能力越強(qiáng)，病斑直徑越??；抑菌帶寬與病斑直徑同樣呈負(fù)相關(guān)，抑菌帶寬越寬，病斑直徑越小。

圖6 定殖量與防病效果的相關(guān)性Fig.6 The correlation between the amount of colonization and the control efficacy

3 討論

本試驗探究生物被膜形成能力與防病能力的相關(guān)性，充分挖掘生防菌防治灰霉病的影響因素。通過構(gòu)建5YN8背景下生物被膜增強(qiáng)型突變體ΔabrB、ΔsinR及生物被膜減弱型突變體Δspo0A、ΔsinI、ΔepsA-O、ΔtasA，觀察不同的的突變體在液氣表面、固氣表面形成生物被膜及在葉面的定殖能力，不同突變體表型研究結(jié)果表明5YN8生物被膜的形成依賴epsA-O、sinI、spo0A、tasA、sinR、abrB基因的調(diào)控，同時生物被膜增強(qiáng)型ΔsinR、ΔabrB在葉片的最終定殖量相比野生型顯著增多，定殖量減少速度相比野生型顯著降低，最終的定殖量穩(wěn)定在1.4×106CFU/g。生物被膜減弱型ΔtasA、ΔepsA-O、ΔsinI、Δspo0A其在葉面的定殖量就顯著少于野生型,最終在葉面的穩(wěn)定定殖量只有6.16×104CFU/g。表明生物被膜與5YN8在葉片的定殖能力具有正相關(guān)性。圖6的相關(guān)性分析表明，防病效果與定殖量具有顯著相關(guān)性，隨著定殖量增加，5YN8的防病效果也顯著增加了。微生物在植物根部的定殖是根際細(xì)菌對植物發(fā)揮有益作用能力的關(guān)鍵步驟，在實驗室條件下，很多研究都表明芽胞桿菌形成生物被膜的能力與其在根際和葉圍的定殖能力緊密相關(guān)，成為芽胞桿菌防病的第一步。解淀粉芽胞桿菌、貝萊斯芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌的定殖能力主要取決于它們形成生物被膜的能力[20]。Chen等[21]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌在番茄根部形成生物被膜從而定殖，Bais等[22]證實構(gòu)建的野生型芽胞桿菌B.subtilis6051的生物被膜減弱型突變體的根際定殖能力與野生型相比顯著下降。

生物被膜除了直接影響生防菌在葉圍和根圍的定殖，國內(nèi)外大量研究表明枯草芽胞桿菌、貝萊斯芽胞干菌生成生物被膜模式對細(xì)菌防病起著至關(guān)重要的作用[8,20]。試驗發(fā)現(xiàn)，在葉圍定殖量增加的生物被膜增強(qiáng)型顯著提高了貝萊斯芽胞桿菌 5YN8的防病效果，生物被膜增強(qiáng)型ΔsinR、ΔabrB其防治效果都達(dá)到了78.94%、80.77%，5YN8的突變體Δspo0A、ΔepsA-O的抑菌率顯著下降了，對于灰霉的防效分別為16.02%，25.06%。不同的突變體平板拮抗效果也顯示出，5YN8生物被膜增強(qiáng)型ΔabrB與ΔsinR對于灰霉病的平板拮抗效果顯示，抑菌帶寬顯著增強(qiáng)，據(jù)圖6通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，防病效果與抑菌帶寬成顯著的正相關(guān)性，首次發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽胞桿菌5YN8抑制灰霉菌的生長與生物被膜的形成具有相關(guān)性。在枯草芽胞桿菌中已發(fā)現(xiàn)生物被膜的形成與其抗生類物質(zhì)的合成相關(guān)，生物被膜缺失型的脂肽類抗生素surfactin分泌減少，而脂肽類抗生素surfactin是芽胞桿菌重要的抗菌活性因素[16]。據(jù)報道，在枯草芽胞桿菌中也發(fā)現(xiàn)生物被膜缺失型分泌的surfactin減少，對于PstDC3000的防病效果顯著下降的現(xiàn)象[5,22]。在貝萊斯芽胞桿菌5YN8中一方面生物被膜的形成可能促進(jìn)了細(xì)菌的生長以及生物量的積累，有研究發(fā)現(xiàn)，Δspo0A的缺失突變體菌株胞外蛋白分泌量顯著減少[23]。另一方面，前期研究發(fā)現(xiàn)，5YN8通過VOCs途徑抑制灰霉菌的生長[10]，生物被膜調(diào)控相關(guān)基因可能對VOC的合成存在直接或間接的調(diào)控作用，從而影響菌株的拮抗能力。本研究結(jié)果顯示貝萊斯芽胞桿菌的生物被膜形成依賴epsA-O、sinI、spo0A、tasA、sinR、abrB基因的調(diào)控，并且生物被膜的形成與貝萊斯芽胞桿菌防治灰霉病具有相關(guān)性，為后續(xù)在生物被膜與防治灰霉的關(guān)系上，對生防菌5YN8防治番茄灰霉病的防治機(jī)理的研究，以及生防芽胞桿菌防治灰霉病的功能修飾增強(qiáng)及田間高效應(yīng)用提供理論依據(jù)。