閆建全，劉 豪，陳力嘉，盧慧林，陳逢浩，侯軍曉，楊 蓉，歐陽雄發(fā)，歐陽革成，孟 翔*

（1.廣東省科學院動物研究所/廣東省動物保護與資源利用重點實驗室/廣東省野生動物保護與利用公共實驗室，廣州 510260；2.華南農業(yè)大學植物保護學院，廣州 510642；3.廣州大學生命科學學院，廣州 510006；4.廣州驕陽農業(yè)公司，廣州 510653；5.廣州歐聯生物科技有限公司，廣州 510520）

黃曲條跳甲Phyllotreta striolata(Fabricus)隸屬鞘翅目Coleoptera葉甲科Chrysomelidae，是嚴重為害白菜、蘿卜、甘藍等十字花科蔬菜的重要害蟲之一[1]。黃曲條跳甲成蟲主要取食植株地上部分，造成葉片孔洞；卵產于莖基部附近土壤，孵化幼蟲于土壤中取食細根或根毛，導致根系吸水能力下降，引起植株地上部葉片萎焉枯死，嚴重影響蔬菜產量和質量[2]。由于田間十字花科蔬菜大面積種植及其常年連作，導致黃曲條跳甲的發(fā)生及為害程度逐年加重，造成了嚴重的經濟損失[3,4]。目前，化學農藥仍舊是防治黃曲條跳甲的主要手段，但化學農藥長期、大量使用，不僅會增加黃曲條跳甲的抗藥性，還對生態(tài)環(huán)境和農產品安全等產生負面影響[5]。因此，尋找黃曲條跳甲的新型綠色安全防治方法至關重要。

植物源甘油酯乳劑（以下簡稱：植物油）是以醬油渣為原料提取植物甘油酯并乳化研制而成的生物源農藥。其作用機理與礦物油相似，主要是通過物理封閉作用在害蟲體表和卵外殼形成致密的油膜，阻塞害蟲氣門和抑制卵外殼的正常氣體交換，導致生命力降低或缺氧窒息；還能夠溶解和破壞細胞膜造成細胞損傷，使害蟲脫水死亡[6]；此外，植物油還可以影響害蟲的行為特性，干擾害蟲的寄主定位，產卵等行為[7]。劉慧等[8]研究發(fā)現90%植物油蒸餾油乳劑150倍液能有效防治柑橘木虱Diaphorina citri(Kuwayama)卵、若蟲和成蟲，且對雌蟲的產卵有拒避作用。油乳劑除了具有殺蟲活性外，其形成的乳化效果可以附著在真菌孢子表面并起到保護作用，使真菌孢子免受干燥和紫外線等不良環(huán)境的侵襲[9,10]，還有利于孢子分散和施藥后在植物表面及昆蟲體表的附著，增強真菌孢子對害蟲的殺傷效果[11]。

利用昆蟲病原微生物控制害蟲是生物防治的重要方法之一，昆蟲病原真菌類殺蟲劑具有寄主范圍廣、持效期長、不污染環(huán)境、不易產生抗藥性以及對人類和非靶標生物相對安全等優(yōu)點，具有廣闊的應用前景[12]。金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae（以下簡稱：綠僵菌）是一類重要的生防真菌，對害蟲特別是寄居于土壤中的害蟲具有較強的觸殺和拒食作用[13,14]，但由于其作用效果緩慢、易受環(huán)境影響等原因，在生產實踐中對害蟲的防控效果有限，嚴重制約其大面積的推廣和使用[15]。如何切實有效地發(fā)揮其在殺蟲過程中的優(yōu)勢，在害蟲的可持續(xù)防控中發(fā)揮作用是目前綠僵菌使用的重點和難點。植物油乳劑在殺蟲的同時，其乳化作用還可能會改善綠僵菌所處的微環(huán)境，保護并增強綠僵菌孢子對害蟲的殺傷作用。目前為止，有關植物源甘油酯乳劑與綠僵菌聯合使用能否顯著地增強對害蟲的殺傷能力仍未見報道。

黃曲條跳甲是十字花科蔬菜重要的害蟲，目前主要通過噴施化學殺蟲劑，調整農業(yè)種植模式，利用信息素誘殺以及生物源農藥等進行防治[16-23]。但是這些防控措施結構單一、生產成本較高，且害蟲易產生耐藥性，從而導致黃曲條跳甲防治效果欠佳。因此，在農業(yè)生產中，需要明確各種防控措施的作用機制，整合多種手段使其達到增效減量的效果，才能更好地滿足現代綠色農業(yè)發(fā)展的要求，達到控制害蟲的目的[24]。本研究以農產品安全生產和生態(tài)環(huán)境友好為防治目標，探究并對比了植物油乳劑和綠僵菌以及二者混配液對黃曲條跳甲的殺傷作用，發(fā)現植物油乳劑和綠僵菌混配液對黃曲條跳甲具有顯著的殺傷作用，且二者之間存在顯著的協同增效作用。本研究不僅為黃曲條跳甲的綠色防控提供技術參考，同時也為利用綠色殺蟲劑之間的協同增效作用，尋找更有益的綠色殺蟲方法提供了有益參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試昆蟲：黃曲條跳甲采集于清遠未噴任何藥劑的十字花科蔬菜地，并轉移至廣東省科學院動物研究所實驗室，利用盆栽美綠菜心飼養(yǎng)多代。

供試菌種：金龜子綠僵菌GDIZMMa-3由自然感病的黃曲條跳甲尸首中分離，并經菌種鑒定和優(yōu)化獲得，菌種保存于廣東省科學院動物研究所環(huán)境昆蟲研究中心。菌種在PDA平板（26±1）℃，光周期14L∶10D下培養(yǎng)7 d，收集分生孢子粉備用。

供試蔬菜：“美綠菜心”分別在室內盆栽和田間栽種，汕頭市實誠種子有限公司。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基成分為馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1000 mL。

藥劑及儀器：93%植物源甘油酯乳劑（廣州歐聯生物科技有限公司，廣東省科學院動物研究所監(jiān)制）；GXZ-380智能光照培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠）；NM930-ZZM光學顯微鏡（深圳市晨晟光學儀器有限公司）；XB-K-25血球計數板（上海求精生化試劑儀器有限公司）；16 L背負式手動噴霧器（臺州市大地機械有限公司）；50 mL手持噴霧瓶（浙江三米容器有限公司）。

1.2 植物油對黃曲條跳甲成蟲的毒力測定

先將植物油與去離子水按照1∶1比例振蕩攪拌均勻，再稀釋至50倍、100倍、200倍、400倍和800倍的供試藥液，質量濃度分別為18.20、9.10、4.55、2.28、1.14 g/L。選取大小相當的菜心，每顆菜心接入20 頭生育期（羽化5～10 d）和活性一致的黃曲條跳甲成蟲，并用25 cm×30 cm的網袋籠罩。使用手持噴霧器進行不同植物油稀釋液噴霧，噴霧量為10 mL。噴霧后，放入（26±1）℃，光周期14 L∶10 D的光照培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。以0.02%吐溫-80無菌水為對照分別于處理后3、6、12、24、48 h統計死亡數，并計算校正死亡率及毒力。每個處理重復3次。

1.3 綠僵菌對黃曲條跳甲成蟲的毒力測定

取少量綠僵菌孢子粉，放入含0.02%吐溫-80的無菌水燒杯中，用磁力攪拌器攪拌，將孢子打散后用雙層擦鏡紙過濾，用血球計數板在顯微鏡下計數，測量母液的濃度，配制成2×108孢子/mL的孢子懸浮液，再依次稀釋成2×108、1×108、5×107、2.5×107、1.25×107孢子/mL的孢子懸浮液備用。試蟲的選取和噴霧方法同1.2。噴霧后，放入光照培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，培養(yǎng)條件同1.2。以0.02%吐溫-80無菌水為對照，逐日檢查（連續(xù)觀察5 d）黃曲條跳甲成蟲的死亡情況并計算校正死亡率及毒力。每個處理重復3次。

1.4 植物油和綠僵菌混配對黃曲條跳甲成蟲的毒力測定

根據1.2和1.3試驗結果，分別選取濃度為0、2×108、1×108孢子/mL的綠僵菌孢子懸浮液和0、100、300倍液植物油稀釋液進行混配，以0.02%吐溫-80無菌水作空白對照，對黃曲條跳甲成蟲進行毒力測定。每個處理設3個重復，每個重復20頭成蟲。試蟲的選取和噴霧方法同1.2。噴霧后，放入光照培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，培養(yǎng)條件同1.2。分別于處理后2、4、6、8、12、16、20、24 h統計死亡數，并計算校正死亡率及毒力。每個處理重復3次。

1.5 植物油和綠僵菌混配對黃曲條跳甲的田間防效

田間藥效試驗在廣州國家現代農業(yè)產業(yè)科技創(chuàng)新中心的菜心樣地進行。田間試驗設4個處理：清水、1×108孢子/mL綠僵菌孢子懸浮液、100倍液植物油、100倍液植物油＋1×108孢子/mL綠僵菌孢子懸浮液。每個處理重復3次，每小區(qū)面積為28 m2（4 m×7 m），每小區(qū)噴施藥液2 L，各小區(qū)之間留1壟不做任何處理，作為緩沖保護區(qū)。所有小區(qū)均使用工農16 L型手動背負式農用噴霧器均勻噴灑。試驗期間不使用其他殺蟲劑，各小區(qū)田間管理與其他菜地一致。

采用5點取樣法調查各小區(qū)黃曲條跳甲成蟲的數量，每點調查5株。施藥前一天調查1次，施藥后第2、4、6、8 d各調查1次。分別記錄每株菜心黃曲條跳甲成蟲的數量。根據統計結果計算蟲口密度(蟲數/百株)、蟲口減退率和相對防效。

1.6 數據統計與分析

試驗數據采用Excel 2010、SPSS19.0軟件進行統計分析。計算死亡率和校正死亡率；毒力回歸方程、LT50及其95%置信限等參數；利用單因素方差分析對蟲口減退率、相對防效、死亡率和校正死亡率試驗數據進行分析，并采用Duncan氏新復極差法比較兩組處理之間的差異顯著性；利用多因素方差分析測定植物油、綠僵菌、作用時間對黃曲條跳甲成蟲死亡率影響。死亡率＝死亡蟲數/供試蟲數×100%；校正死亡率＝（處理組的死亡率―對照組的死亡率）/（1―對照組的死亡率）×100%；蟲口減退率＝（處理前處理蟲量―處理后處理蟲量）/處理前處理蟲量×100%；相對防治效果＝1―（處理前對照蟲量×處理后處理蟲量）/（處理后對照蟲量×處理前處理蟲量）×100%。

2 結果與分析

2.1 植物油對黃曲條跳甲成蟲的毒力

不同稀釋倍數的植物油對黃曲條跳甲成蟲的毒力測定結果見表 1。在噴施不同稀釋倍數的植物油 2 d時，黃曲條跳甲成蟲的校正死亡率隨著供試植物油濃度升高而顯著增加（F＝64.90，P＜0.001）。毒力測定表明：隨著植物油稀釋倍數的增加，黃曲條跳甲成蟲的致死中時（LT50）逐漸延長（F＝69.21，P＜0.001）。以上結果表明，不同濃度的植物油對黃曲條跳甲成蟲毒力具有顯著差異，且LT50隨著植物油濃度的增加而明顯縮短。

表1 不同濃度植物油對黃曲條跳甲成蟲的毒力Table 1 Toxicity of different concentrations of plant spray oil to P.striolata adult

2.2 綠僵菌對黃曲條跳甲成蟲的毒力

不同濃度綠僵菌孢子懸浮液對黃曲條跳甲成蟲的毒力測定結果表明，黃曲條跳甲成蟲的累計死亡率隨著綠僵菌孢子濃度和孢子的作用時間的增加而上升（圖 1），致死中時隨著綠僵菌孢子濃度增加而顯著降低（F＝12.34，P＝0.007，表2）。當綠僵菌孢子懸浮液濃度較高時（2×108孢子/mL），殺蟲效果最好，在施藥第2 d時其死亡率顯著高于對照組（F＝71.10，P＜0.001），在第5 d時，黃曲條跳甲成蟲的死亡率和校正死亡率均高于 90%（表 2）；當綠僵菌孢子濃度較低時（1.25× 107孢子/mL），其對黃曲條跳甲成蟲的防治效果降低，且殺蟲效果與綠僵菌的作用時間相關，其死亡率在4 d以后會顯著高于對照組（4 d，F＝72.24，P＜0.001；5 d，F＝49.38，P＜0.001）。

表2 不同濃度綠僵菌對黃曲條跳甲成蟲的毒力Table 2 Toxicity of different concentrations of M.anisopliae to P.striolata adult

圖1 不同孢子濃度下綠僵菌對黃曲條跳甲成蟲的作用時間-死亡率比較Fig.1 Comparison of time-mortality relationship M.anisopliae on P.striolata adult inoculated with spores at varied concentrations

2.3 植物油和綠僵菌混用對黃曲條跳甲成蟲的毒力

根據2.1和2.2的試驗結果，選取植物油100倍液、300倍液與綠僵菌濃度2×108、1×108孢子/mL分別進行混配，測定混配液對黃曲條跳甲成蟲的毒力。結果表明，植物油和綠僵菌混配液對黃曲條跳甲成蟲控制作用顯著，黃曲條跳甲成蟲在同一時間的累計死亡率均高于植物油和綠僵菌單劑處理（圖 2），24 h的校正死亡率大于95%（表3）。多因素方差分析結果表明，植物油和綠僵菌的作用時間會顯著地影響黃曲條跳甲成蟲的死亡率，但短時間內綠僵菌對黃曲條跳甲成蟲的死亡影響較小。多因素方差分析的交互結果顯示，綠僵菌和植物油具有顯著的交互作用，能夠增強對黃曲條跳甲的防控效果（表4）。

表3 植物油和綠僵菌混用對黃曲條跳甲成蟲的毒力Table 3 Toxicity of plant spray oil mixed with M.anisopliae to P.striolata adult

表4 植物油、綠僵菌及時間的相互作用對黃曲條跳甲成蟲死亡率影響的多因素方差分析Table 4 Multi-factor variance analysis of mortality P.striolata adults in the treatments of plant spray oil with M.anisopliae

圖2 植物油和綠僵菌混用對黃曲條跳甲成蟲作用時間-死亡率比較Fig.2 Comparison of P.striolata adult time-mortality relationship in the treatments of plant spray oil with M.anisopliae

2.4 不同處理對黃曲條跳甲成蟲的田間防治效果

根據室內試驗的結果，通過田間試驗進一步測試了植物油和綠僵菌以及二者混配液對黃曲條跳甲成蟲的防控效果（圖 3）。為降低試驗誤差，試驗開始前統計了各小區(qū)的黃曲條跳甲成蟲的種群密度，結果顯示各小區(qū)黃曲條跳甲成蟲數量基本一致，保證了后續(xù)結果的一致性。對比植物油和綠僵菌以及二者混配液對黃曲條跳甲成蟲的控制作用結果表明，植物油和綠僵菌混配液對黃曲條跳甲成蟲具有較強的殺傷作用顯著高于兩種單劑，并且混配液對黃曲條跳甲成蟲種群的增長具有持續(xù)控制的效果（2 d，F＝65.70，P＜0.001；4 d，F＝332.08，P＜0.001；6 d，F＝343.83，P＜0.001；8 d，F＝641.55，P＜0.001）。通過分析不同藥劑處理后黃曲條跳甲成蟲的種群密度變化情況可以看出，噴施植物油后會較快地降低黃曲條跳甲成蟲的種群密度；綠僵菌對黃曲條跳甲成蟲的防控起效慢，但持續(xù)時間長；植物油和綠僵菌的混配液可以快速控制黃曲條跳甲成蟲種群密度同時在后期能夠持續(xù)地降低黃曲條跳甲成蟲種群（圖3A）。進一步的分析表明，植物油和綠僵菌的混配液前期主要是植物油起作用，而后期長時間的持續(xù)控制作用主要是綠僵菌起作用。

為進一步評價上述三種藥劑對黃曲條跳甲成蟲的防控效果，試驗計算并比較了三種藥劑處理的相對防效和蟲口減退率（圖3B和圖3C），與黃曲條跳甲成蟲種群密度變化一致，植物油和綠僵菌混配液對黃曲條跳甲成蟲的相對防效和蟲口減退率顯著高于植物油和綠僵菌單劑處理（8 d：相對防效，F＝93.30，P＜0.001；蟲口減退率，F＝322.20，P＜0.001）。植物油對黃曲條跳甲的防治速度快，后期相對防效變化不大；綠僵菌孢子懸浮液對黃曲條跳甲成蟲的防治效果較低且作用緩慢，但持效期長，而植物油和綠僵菌混和施用可以顯著提高對黃曲條跳甲的防治效果，彌補植物油和綠僵菌防治過程中的缺點。

圖3 田間施用綠僵菌、植物油和混合施用對黃曲條跳甲成蟲的田間防效Fig.3 Field control efficacy of P.striolata adult after spraying of M.anisopliae, plant spray oil and their mixture in the field

3 討論

利用綠色安全的殺蟲劑防治蔬菜害蟲不僅能保證食品的安全生產，同時也會降低農藥殘留和對環(huán)境的污染，綜合利用和探究各綠色殺蟲劑之間的協同作用，可為新型農藥的開發(fā)以及防控田間害蟲提供新的方法和手段。植物源甘油酯（植物油）和綠僵菌均為農業(yè)生產過程中常用的綠色無公害殺蟲劑，但其二者混配后使用是否可以增加對害蟲的防控效果仍缺乏相關研究。本試驗測試了植物油和綠僵菌以及二者聯合使用對黃曲條跳甲成蟲的防控作用，結果表明植物油和綠僵菌混配液可以增強各自的殺蟲和防控效果，同時混配液還可以顯著地延長對黃曲條跳甲成蟲的控制時長。

植物油是從發(fā)酵食品中提取的新型植物油脂，具有在環(huán)境中易降解、生產成本低、對天敵安全、害蟲不會產生抗藥性等特點，對小型害蟲和一些葉面微生物病害的防控起重要作用[8]。例如，臭氧化植物油具有殺菌和愈合傷口的功效，可用于蘋果腐爛病的防治[25]；蓖麻油可用于田間小菜蛾Plutella xylostella(Linnaeus)幼蟲防治，且會拒避小菜蛾成蟲產卵[26]。該試驗的室內結果表明，植物油可以用于防控黃曲條跳甲成蟲且對黃曲條跳甲成蟲殺傷作用會隨著植物油濃度的增加而增大，并且100倍液植物油稀釋液對黃曲條跳甲成蟲的殺傷作用高于90%，且致死中時顯著降低，但田間試驗過程中發(fā)現植物油的殺傷作用低于室內效果，這可能與田間環(huán)境變化相關。

綠僵菌是廣泛分布于自然界中的一類重要的昆蟲病原真菌。目前已用于防治甜菜夜蛾Spodopteraexigua(Hübner)、褐飛虱Nilaparvata lugens(St?l)、蝗蟲等害蟲[14]，但其殺蟲效果相對較慢，在施藥初死亡率較低，受環(huán)境影響較大[27-29]。本文測試了綠僵菌在室內對黃曲條跳甲成蟲的防治效果，發(fā)現低濃度綠僵菌對黃曲條跳甲成蟲的殺傷作用較低，高濃度下對黃曲條跳甲成蟲的殺傷效果明顯，但其殺蟲速度緩慢，遠低于植物油的防控效果和速度。田間試驗表明，高濃度的綠僵菌對黃曲條跳甲的防控起效時間慢，但持效期長，這可能由于綠僵菌可以一定程度上在施藥后增殖，能夠長期存活在環(huán)境中并侵染害蟲有關。

室內和田間的試驗結果表明，植物油和綠僵菌的混配液對黃曲條跳甲成蟲的防控效果均顯著高于兩種單劑，并且多因素方差分析結果顯示植物油和綠僵菌具有顯著的相互作用。二者的混配液可能改變了制劑的性狀，進而增強了殺蟲效果。已有的研究顯示，植物油不僅可以通過覆膜直接殺死害蟲，其還具有乳化作用，可作為助劑協助其他農藥在生物體表面上的展布、潤濕和沉積，增加農藥在植物表面的滲透和覆蓋面，達到增效的作用[6]。植物油和綠僵菌混配可能會增強綠僵菌的粘著力和滲透性，使其更易侵入寄主。此外，植物油乳化后會在接觸面形成油膜，形成的微環(huán)境可以抵御紫外線、高溫、干燥等不良環(huán)境，延長了孢子的存活時間，使其能順利萌發(fā)和侵染；同時植物油在昆蟲體表形成致密的油膜，還可能會改變害蟲生理代謝以及免疫活性等，由此增加了真菌孢子的侵染活力，這些仍需進一步的探究。

對比植物油和綠僵菌混配液與兩種單劑在田間的防控效果發(fā)現植物油和綠僵菌混配液在殺蟲前期主要是植物油起到殺蟲作用，而綠僵菌可以持續(xù)的降低害蟲的種群密度，增強藥效的持續(xù)時間，彌補植物油施用后期殺蟲效果的不足。二者的混配液不僅可以降低各自在害蟲防控中的缺點，達到協同增效作用，同時還可以降低田間的施藥頻次。對比其他常見的黃曲條跳甲防治藥劑，植物油和綠僵菌混配液第8 d的相對防效高達89.80%，顯著高于普通藥劑，同時植物油和綠僵菌的混配液不會引起害蟲的抗藥性，并且對人類健康和對環(huán)境友好是理想的綠色防控藥劑。

病蟲害的綠色防控是近些年來對害蟲防治過程中的理念，通過綜合利用各種手段以及綠色農藥控制病蟲害的發(fā)生。在使用過程中發(fā)現大多數的綠色農藥普遍殺蟲效果不好，導致綠色農藥的推廣和使用受到限制，探究綠色農藥之間的相互作用，增強綠色農藥的殺蟲效果，有利于其使用和推廣，但目前這些研究仍然較少。本試驗證實了植物油與綠僵菌組合對黃曲條跳甲成蟲的防控具有協同增效作用，不僅增加了黃曲條跳甲的綠色防控手段同時也為其他害蟲的防控提供了依據，該研究還為利用綠色農藥間的協同作用控制病蟲害提供了案例，同時在綠色食品生產，農藥減量增效和生態(tài)環(huán)境保護等方面具有重要的指導意義。