張 莉，朱雪霞，沈文靜，劉 標(biāo)*

（1.生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所/國家環(huán)境保護(hù)生物多樣性與生物安全重點(diǎn)實驗室，南京 210042；2.河海大學(xué)海洋學(xué)院，南京 210098）

轉(zhuǎn)基因玉米為全球糧食安全做出巨大貢獻(xiàn)，截止到2019年，全球轉(zhuǎn)基因玉米種植面積達(dá)6090萬公頃，占轉(zhuǎn)基因作物總種植面積的31%[1]，全球生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因玉米主要用于飼料、加工和糧食，其中飼用轉(zhuǎn)基因玉米及其副產(chǎn)物的比例可達(dá)轉(zhuǎn)基因玉米的 85%[2]。轉(zhuǎn)基因玉米在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用的同時[3]，其飼喂安全性問題不容忽視。如攝入含有轉(zhuǎn)基因成分的飼料后是否會對動物的生長、繁殖有潛在的不利影響[4]？轉(zhuǎn)基因飼料經(jīng)動物取食后，在動物胃腸道消化降解過程中是否會產(chǎn)生殘留[5]？轉(zhuǎn)基因食品及飼料面臨的種種安全性疑慮一定程度上影響了其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用，且轉(zhuǎn)基因作物作為飼料的歷史并不久，飼用轉(zhuǎn)基因飼料是否會對動物乃至人類產(chǎn)生不良影響，仍然是有待于研究的課題。

魚類作為水生生態(tài)系統(tǒng)中最重要的生物組成之一，發(fā)揮著重要的生態(tài)功能，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因作物在魚飼料加工中的應(yīng)用越來越廣泛，轉(zhuǎn)基因作物對魚類的潛在飼喂風(fēng)險的安全評價也愈發(fā)重要。目前已有一些研究者開展了轉(zhuǎn)基因作物飼料對魚類的飼用安全性評價研究，這些研究者主要集中于對大西洋鮭Salmo salar[6-9]、虹鱒Oncorhynchus mykiss[10-12]的研究，相比于大西洋鮭和虹鱒，斑馬魚Danio rerio具有體型小，發(fā)育周期短，產(chǎn)卵量大、胚胎透明易于觀察等諸多優(yōu)點(diǎn)[13-15]，作為模式動物在遺傳學(xué)、發(fā)育學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等多學(xué)科領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[16-18]。轉(zhuǎn)基因作物應(yīng)用于飼料領(lǐng)域后，一些研究者開始關(guān)注轉(zhuǎn)基因作物飼料對斑馬魚的影響，這些研究所涉及到的轉(zhuǎn)基因作物主要為轉(zhuǎn)基因大豆[19]或者單一性狀的轉(zhuǎn)基因玉米[20,21]對斑馬魚生長、食物轉(zhuǎn)化效率和體內(nèi)酶活性的影響，而對斑馬魚繁殖及外源蛋白體內(nèi)殘留情況的研究還比較少。

玉米作為我國糧飼兼用型作物，一直是國內(nèi)轉(zhuǎn)基因研發(fā)領(lǐng)域的重點(diǎn)。自 2008年轉(zhuǎn)基因重大專項實施后，自主基因、自主技術(shù)、自主品種的研發(fā)能力顯著提升，已研發(fā)出一批具有商業(yè)化應(yīng)用前景的轉(zhuǎn)基因玉米品種[22]。2020年1月，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部為2個玉米品種和1個大豆品種頒發(fā)了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書（生產(chǎn)應(yīng)用），進(jìn)一步加速了轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。DBN9936玉米作為本次獲批的玉米品種之一，由大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司自主研發(fā)，該品種對鱗翅目害蟲和草甘膦有較好抗性[23,24]，具有廣闊的應(yīng)用前景，未來DBN9936轉(zhuǎn)基因玉米推廣和應(yīng)用時仍需進(jìn)行轉(zhuǎn)基因安全監(jiān)管。另外，DBN9936作為新的轉(zhuǎn)化體具有抗蟲和耐除草劑兩種抗性，目前同時表達(dá)兩種外源蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米對魚類的飼喂安全性研究還未見報道。本研究以斑馬魚為研究對象評價DBN9936玉米的飼用安全性，旨在為DBN9936轉(zhuǎn)基因玉米飼用安全性以及預(yù)測該轉(zhuǎn)基因玉米商業(yè)化種植后對魚類的影響提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 玉米及飼料配置

供試材料為大北農(nóng)集團(tuán)有限公司提供的抗蟲和耐除草劑雙價轉(zhuǎn)基因玉米 DBN9936（外源基因cry1Ab和epsps）籽粒及其非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩譊BN9858籽粒。玉米籽粒在本實驗室封閉溫室條件下盆栽種植，收獲后自然風(fēng)干使用TC-10型超音速氣流粉碎分級機(jī)進(jìn)行低溫（＜10 ℃）粉碎至粒徑10 μm，以22%劑量添加到斑馬魚飼料中[19]，飼料主要組分和營養(yǎng)成分見表1。制成的斑馬魚飼料為顆粒狀，粒徑400 μm，制備后的飼料于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

使用玉米Cry1Ab和EPSPS檢測試劑盒（Envirologix）對隨機(jī)選取的5份DBN9936、DBN9858飼料和商品化飼料進(jìn)行Cry1Ab和EPSPS蛋白進(jìn)行測定，結(jié)果顯示DBN9936兩種蛋白的表達(dá)量分別為（0.11±0.09）μg/g和（11.47±0.96）μg/g，DBN9858和商品化飼料組檢測結(jié)果均顯示陰性。分別隨機(jī)抽取3份轉(zhuǎn)基因玉米飼料和親本玉米飼料進(jìn)行營養(yǎng)成分測定，經(jīng)測定兩種飼料在蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉等主要營養(yǎng)成分含量一致（表1）。

表1 玉米飼料配方和主要營養(yǎng)成分Table 1 Ingredients and nutritional components of the non-GM maize and GM maize diets

1.2 試驗動物和培養(yǎng)方法

受試斑馬魚60日齡，初始平均體長（2.1846±0.348）cm，平均體質(zhì)量（0.22869±0.052）g（n＝10），試驗前來自同一批次的斑馬魚在與試驗相同水質(zhì)和光照的條件下馴養(yǎng)14 d，在馴化期間的死亡率為2%。

試驗設(shè)置商品化飼料組（商品化飼料為市售寸金熱帶魚飼料）、DBN9858玉米飼料組和DBN9936玉米組3個處理，每處理3個重復(fù)，每重復(fù)30條斑馬魚。試驗在30 cm×30 cm×25 cm的獨(dú)立玻璃培養(yǎng)缸中進(jìn)行，容水10 L，每個培養(yǎng)缸設(shè)置獨(dú)立的過濾系統(tǒng)。試驗中每3 d更換1/3體積的培養(yǎng)水，試驗在水溫（28±0.5）℃，pH（7.8±0.2），光周期14L∶10D的環(huán)境下進(jìn)行56 d。

試驗時，每日8：00，13：00和17：00投食3次，投食量為魚的初始重量的4%，每2周根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整投喂量，每天觀察并記錄斑馬魚活動性、食性、外觀狀況和死亡情況。

1.3 體長和體質(zhì)量

培養(yǎng)14、28、42和56 d時，隨機(jī)從各處理缸中撈取10條斑馬魚，饑餓自凈24 h后，使用90 mg/L MS-222麻醉劑處理試驗魚1.5 min后，測定每條魚的體長和體質(zhì)量，測定后立即將試驗魚放入培養(yǎng)水中進(jìn)行復(fù)蘇，隨后轉(zhuǎn)入相應(yīng)的培養(yǎng)缸中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 繁殖

56 d飼喂結(jié)束后，各處理組每缸隨機(jī)選取6條雄魚和3條雌魚，按照雌雄比1∶2比例進(jìn)行配對，配對在繁殖缸中進(jìn)行，配對當(dāng)日傍晚用隔離板將雌、雄魚分開，次日7：00將隔離板去除，2 h后將親魚移至培養(yǎng)缸，并使用前端修剪過的巴氏吸管將魚卵收集至盛有35 mL培養(yǎng)水的結(jié)晶皿中。統(tǒng)計各組親魚產(chǎn)卵量、受精卵個數(shù)、死亡卵個數(shù)，隨后將受精卵使用新鮮10% Hank’s清洗干凈，置于28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜水培養(yǎng)，每日觀察受精卵孵化情況，每隔一天更換培養(yǎng)皿用水，對72 h內(nèi)孵出仔魚數(shù)和幼魚畸形情況進(jìn)行計數(shù)。

1.5 組織樣品Cry1Ab蛋白和EPSPS蛋白Western檢測

56 d時，將每缸試驗魚全部取出，麻醉后冰上解剖，取試驗魚肌肉、肝臟、腸道組織，使用4 ℃清水將組織清洗干凈，液氮研磨后用RIPA裂解液（Sigma）4 ℃振蕩裂解30 min，4 ℃ 10000 r/min離心5 min，收集上清液用于蛋白濃度測定和SDS-PAGE凝膠電泳。蛋白質(zhì)濃度使用BCA試劑盒（Beyotime）測定。

SDS-PAGE凝膠電泳和蛋白免疫印跡參照Zhang等[25]方法。蛋白上清液與6×上樣緩沖液混勻后，98℃ 煮10 min，10000 r/min離心10 min，取上清上樣至10% SDS-PAGE凝膠電泳中，上樣量約50 μg。電泳結(jié)束后使用濕法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜（Bio Rad）上進(jìn)行免疫印跡分析，具體操作步驟見文獻(xiàn)[25]，測定中以α-tubulin為斑馬魚樣品內(nèi)參蛋白，以DBN9936轉(zhuǎn)基因玉米提取的總蛋白為陽性對照，在雙色紅外激光成像系統(tǒng)（Licor Odyssey）中顯示結(jié)果。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2010統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（x±SD）表示。使用SPSS 19.0軟件ANOVA程序進(jìn)行單因子方差分析，Tukey’s test進(jìn)行多重比較，以P＜0.05作為統(tǒng)計學(xué)上檢驗的顯著性水準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 體長

不同飼料處理組斑馬魚的體長如圖1。在56 d試驗期內(nèi)，兩個玉米粉組試驗斑馬魚體長增長模式大體一致，至試驗結(jié)束時轉(zhuǎn)基因玉米組斑馬魚體長與親本玉米飼料組分別為（38.45±1.73）mm 和（38.57±1.97）mm，二者沒有顯著性差異，其他測定時間轉(zhuǎn)基因玉米飼料組斑馬魚體長與親本玉米飼料組也無顯著性差異（P＞0.05）。與商品化飼料相比，除第56 d親本玉米飼料組和轉(zhuǎn)基因玉米組斑馬魚體長顯著較低外，其余測定時間內(nèi)3個處理組斑馬魚體長并沒有差別。

圖1 不同處理組斑馬魚體長變化Fig.1 Body length of zebrafish fed commercial, non-GM maize, and GM maize diets

2.2 體質(zhì)量

14～56 d試驗期內(nèi)，商品化飼料組斑馬魚體質(zhì)量與轉(zhuǎn)基因玉米粉組沒有差異，與此不同的是，在試驗第42 d和56 d時，親本玉米組斑馬魚體質(zhì)量較商品化飼料組斑馬魚低，分別為（0.354±0.027）g和（0.363±0.034）g，并與同一測定時間商品化飼料組斑馬魚體質(zhì)量有顯著性差異。14～28 d內(nèi)，轉(zhuǎn)基因玉米組和親本玉米組斑馬魚體質(zhì)量相當(dāng)，至42～56 d時，雖然轉(zhuǎn)基因玉米組體質(zhì)量較親本玉米組體質(zhì)量稍高，但二者并沒有達(dá)到顯著性差異水平（P＞ 0.05），不同飼料處理組斑馬魚體質(zhì)量隨時間變化情況見圖2。

圖2 不同處理組斑馬魚體質(zhì)量變化Fig.2 Mean body weights of zebrafish fed commercial, non-GM maize, and GM maize diets

2.3 繁殖

不同處理組斑馬魚的繁殖情況見表2。相對于商品化飼料組，2個玉米粉組斑馬魚表現(xiàn)出一些繁殖劣勢，主要表現(xiàn)為產(chǎn)卵數(shù)和受精卵數(shù)下降，這兩組參數(shù)與商品化飼料組有顯著性差異，但在受精卵率、孵化率和仔魚畸形率參數(shù)上，商品化飼料組和兩個玉米粉組并沒有顯著差異。另外，轉(zhuǎn)基因玉米組和親本玉米組斑馬魚在所有繁殖參數(shù)上均沒有顯著性差異（P＞0.05）。

表2 不同處理組斑馬魚繁殖指標(biāo)Table 2 Reproduction of zebrafish fed commercial, non-GM maize, and GM maize diets

2.4 樣品Cry1Ab蛋白和EPSPS蛋白Western blot檢測

如圖3A所示，所有樣本的內(nèi)參α-tubulin蛋白在55 kDa左右都顯示清晰條帶，說明樣本蛋白提取質(zhì)量符合Western Blot分析需求。由不同處理組斑馬魚肌肉、肝臟和腸道組織樣品Cry1Ab蛋白（圖3B）和EPSPS（圖3C）蛋白Western blot檢測結(jié)果可知，陽性對照轉(zhuǎn)基因玉米樣品中可檢測到Cry1Ab蛋白和EPSPS蛋白條帶，而飼喂商品化飼料（泳道1～3）、非轉(zhuǎn)基因玉米飼料（泳道4～6）和轉(zhuǎn)基因玉米飼料組（泳道7～9）的斑馬魚肌肉、肝臟、腸道樣品均未檢測到Cry1Ab蛋白和EPSPS蛋白殘留。

圖3 不同飼料處理組斑馬魚組織樣品中Cry1Ab蛋白和EPSPS蛋白檢測Fig.3 Western blot analysis of transgenic Cry1Ab and EPSPS proteins in the tissues of zebrafish fed commercial, non-GM maize,and GM maize diets

3 討論

隨著生產(chǎn)加工中越來越廣泛地使用轉(zhuǎn)基因作物作為飼料原料，對轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品可能存在的安全問題進(jìn)行動物飼喂試驗已是轉(zhuǎn)基因作物環(huán)境安全評價的重要內(nèi)容[26]。魚類作為人類蛋白質(zhì)食物主要來源之一，人們不僅關(guān)注攝入轉(zhuǎn)基因飼料是否會影響魚類健康，還關(guān)注轉(zhuǎn)基因成分是否會在魚肉等產(chǎn)品中產(chǎn)生殘留，因此以魚類為研究對象進(jìn)行轉(zhuǎn)基因作物的飼用安全性評價研究時，不僅應(yīng)關(guān)注飼喂轉(zhuǎn)基因作物飼料一段時間后，魚類生長和繁殖是否受到影響，還應(yīng)關(guān)注外源轉(zhuǎn)基因成分在體內(nèi)被消化和累積的情況。

本研究通過56 d飼喂試驗表明，與飼喂DBN9858親本玉米飼料的斑馬魚相比，DBN9936玉米粉組斑馬魚在體長和體質(zhì)量參數(shù)上與親本玉米飼料組沒有顯著性差異，說明DBN9936轉(zhuǎn)基因玉米并沒有引起斑馬魚生長方面的不良反應(yīng)。Sanden等[21]研究使用含有 19%轉(zhuǎn)cry1Ab基因玉米的飼料飼喂斑馬魚 283 d，結(jié)果表明斑馬魚體質(zhì)量未受到影響，與本研究結(jié)果一致。Sissener等[19]使用轉(zhuǎn)基因玉米MON810飼喂斑馬魚20 d、董姍姍等[20]用轉(zhuǎn)cry1Ab基因玉米BT799飼喂斑馬魚98 d也得到了相似的結(jié)論。本研究與上述研究者的結(jié)果表明，攝入轉(zhuǎn)基因玉米飼料后斑馬魚生長良好，斑馬魚體長和體質(zhì)量未受到影響。

試驗期內(nèi)，攝入含有DBN9936轉(zhuǎn)基因玉米飼料的斑馬魚在產(chǎn)卵數(shù)和受精率上與DBN9858親本玉米組斑馬魚沒有顯著性差異，受精卵靜水孵化后，孵化率和仔魚畸形率也和親本飼料組相當(dāng)。和本研究結(jié)果相似的是，董姍姍等[20,27]也指出使用轉(zhuǎn)cry1Ab基因玉米BT799和轉(zhuǎn)Cry1Ie基因玉米IE09S034飼喂斑馬魚98 d后，轉(zhuǎn)基因玉米對斑馬魚產(chǎn)卵量和孵化率沒有影響；在Sanden等[21]研究者的長期飼喂研究中，轉(zhuǎn)基因玉米組斑馬魚的產(chǎn)卵量甚至稍高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M，說明轉(zhuǎn)基因玉米飼料沒有對斑馬魚繁殖產(chǎn)生不利影響。另外，兩個玉米飼料組在受精卵率、孵化率、仔魚畸形率與商品化飼料組也沒有顯著性差異，說明本研究自制的玉米飼料能夠滿足斑馬魚繁殖營養(yǎng)需求。值得指出的是，在使用自制玉米飼料飼喂斑馬魚后，相比于商品化飼料，雖然兩個玉米飼料組在受精卵率、孵化率和仔魚畸形率與商品化飼料組沒有顯著性差異，但玉米飼料組斑馬魚仍然表現(xiàn)出產(chǎn)卵量下降的繁殖劣勢。與商品化膨化飼料不同的是，本研究自制的顆粒型飼料未添加任何非營養(yǎng)性添加劑（如誘食劑、生長促進(jìn)劑等），玉米粉中的抗?fàn)I養(yǎng)因子也會使飼料適口性降低[28]，這些因素可能導(dǎo)致玉米飼料組斑馬魚在攝食量、飼料消化率和利用率等方面有所降低，從而影響魚類性腺發(fā)育和繁殖水平[29]。

轉(zhuǎn)基因飼料中的外源成分在動物體內(nèi)的消解和轉(zhuǎn)移不僅是轉(zhuǎn)基因飼料安全性評價的重要環(huán)節(jié)，也是人們非常關(guān)心的食品安全問題[25]。對斑馬魚肌肉、肝臟和腸道樣品進(jìn)行外源蛋白Western blot檢測，沒有在相應(yīng)組織檢測到Cry1Ab或EPSPS蛋白，說明斑馬魚在吸收飼料營養(yǎng)成分過程中，肌肉、肝臟和腸道組織中未發(fā)生外源蛋白的轉(zhuǎn)移和殘留。目前轉(zhuǎn)基因作物對魚類的飼用安全性研究中，涉及到外源蛋白在組織中殘留的研究還很少，僅有一些研究者檢測了攝食轉(zhuǎn)基因玉米后魚類組織器官中外源 DNA殘留情況。Sissener等[19]表明飼喂MON810轉(zhuǎn)基因玉米飼料后，斑馬魚腸道中可以檢測到外源基因DNA片段，Dong等[30]使用數(shù)字PCR方法也可在斑馬魚肌肉等樣品檢測到外源基因DNA片段，Chainark等[11]在虹鱒魚中也有相似的結(jié)論，與本研究中外源蛋白沒有在斑馬魚組織樣品中殘留結(jié)果不同的是，這些針對外源基因殘留的研究表明飼料中的外源 DNA片段或能通過組織循環(huán)轉(zhuǎn)移至其他組織[31]，上述結(jié)果的差異可能與飼料加工技術(shù)對外源基因和外源蛋白的影響不同，也可能與蛋白水平和基因水平檢測方法靈敏度差異等因素有關(guān)。雖然本研究采用的Western blot方法能夠靈敏地檢測外源蛋白和降解后的外源蛋白殘留片段，但不排除斑馬魚組織中存在低于檢測極限的痕量外源蛋白的可能，因此，外源蛋白在魚類組織中的殘留情況還需要進(jìn)一步研究驗證。

綜上所述，飼喂轉(zhuǎn)基因玉米56 d，斑馬魚生長良好，體長、體質(zhì)量和繁殖參數(shù)與DBN9858親本對照組未有顯著性差異，DBN9936轉(zhuǎn)基因玉米飼料并沒有引起斑馬魚在生長和繁殖方面的不良反應(yīng)，轉(zhuǎn)基因外源蛋白也未在肌肉、肝臟、腸道組織中殘留，說明轉(zhuǎn)基因玉米 DBN9936飼料中的外源成分沒有增加斑馬魚健康風(fēng)險。