段云鵬，姚 雪，李 品，王萌涵，胡守印，胡恩靜，劉永剛，楊淑芳，魏紀(jì)珍

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/河南省害蟲(chóng)綠色防控國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002）

轉(zhuǎn)基因作物表達(dá)蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis（Bt）殺蟲(chóng)基因是迄今為止生物技術(shù)對(duì)農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)防治的最重要貢獻(xiàn)。Bt作物已在29個(gè)國(guó)家廣泛種植，全球面積超過(guò)1億公頃，占全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的53%[1]。盡管轉(zhuǎn)Bt作物在全球得到了廣泛的種植，但是有關(guān)Bt殺蟲(chóng)蛋白的作用機(jī)制和昆蟲(chóng)對(duì)Bt殺蟲(chóng)蛋白的抗性機(jī)制還沒(méi)有被完全解析。更為嚴(yán)重的是，抗性問(wèn)題日益突出，近年來(lái)報(bào)道的昆蟲(chóng)抗性和田間防治失敗的案例也在持續(xù)增加[2-4]。Cry1Ac作為最重要的Bt殺蟲(chóng)基因之一，最先在作物中表達(dá)，用于防治棉鈴蟲(chóng)等鱗翅目害蟲(chóng)。目前，第一代轉(zhuǎn)Cry1Ac基因棉花已在我國(guó)種植了26年，盡管有“天然庇護(hù)所”的保護(hù)，田間棉鈴蟲(chóng)種群對(duì)Cry1Ac的抗性也在顯著增加[5-7]。因此，需要對(duì)Bt殺蟲(chóng)蛋白的作用機(jī)制和抗性機(jī)理進(jìn)行更加深入的研究。

前期對(duì)Bt殺蟲(chóng)蛋白，尤其Cry1類蛋白受體和昆蟲(chóng)對(duì)Cry1類蛋白的抗性機(jī)制研究表明，其主要功能受體包括鈣黏蛋白（cadherin）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）、氨肽酶（aminopeptidases-N）、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白C2（ATP binding cassette subfamily C member 2，ABCC2）和三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 C3（ABCC3）等[8-12]。近些年來(lái)的研究通過(guò)雙向電泳等方法也表明 V-ATPase亞基蛋白可以與Bt蛋白結(jié)合[13-15]，而且V-ATPase參與Bt的作用過(guò)程[16]，甚至改變V-ATPase的表達(dá)能夠引起昆蟲(chóng)對(duì)Bt的耐性[17]。這說(shuō)明V-ATPase亞基蛋白可能作為Bt的作用靶標(biāo)正在逐步的被我們認(rèn)識(shí)。

V-ATPase是一種在真核生物中進(jìn)化古老的，高度保守的酶，存在于許多細(xì)胞器的膜中，如核內(nèi)體、溶酶體和分泌囊泡，它們?cè)谶@些細(xì)胞器的功能中發(fā)揮著各種重要作用[18]。它可以使細(xì)胞內(nèi)的很多細(xì)胞器酸化，偶聯(lián)ATP水解的能量，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)和真核細(xì)胞的質(zhì)膜質(zhì)子運(yùn)輸。這類酶的研究目前在其結(jié)構(gòu)、功能、規(guī)律以及體外機(jī)制的闡述方面取得了巨大的進(jìn)步，很多貢獻(xiàn)歸因于在昆蟲(chóng)中的研究[19]。在昆蟲(chóng)中V-ATPase是一種多亞基組成的膜結(jié)合復(fù)合酶體[15]，是昆蟲(chóng)中腸上皮細(xì)胞 H+離子轉(zhuǎn)運(yùn)體[16]。大量的證據(jù)表明昆蟲(chóng)的V-ATPase在Cry蛋白毒性中發(fā)揮作用[13,15,20-23]。鑒于其分布和功能的多樣化，以及與Bt的作用關(guān)系，迫切地需要發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證V-ATPase亞基蛋白在Bt的作用機(jī)制和抗性機(jī)制中的作用。

我們?cè)谇捌诘难芯恐型ㄟ^(guò)構(gòu)建棉鈴蟲(chóng)的中腸酵母文庫(kù)篩選 Cry1Ac的結(jié)合蛋白中發(fā)現(xiàn)，棉鈴蟲(chóng) VATPase B可以與Cry1Ac結(jié)合，這與鄒朗云等[24]報(bào)道的V-ATPase B可以與Cry1Ac結(jié)合的結(jié)果一致。VATPase B作為Cry1Ac的結(jié)合蛋白是否參與Cry1Ac的毒力過(guò)程還沒(méi)有得到證實(shí)。本研究首先采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析該基因在抗感Cry1Ac棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)及其受到Cry1Ac誘導(dǎo)時(shí)的表達(dá)情況；通過(guò)配體雜交 Ligand blot進(jìn)一步地證實(shí)了其與 Cry1Ac的結(jié)合特性；通過(guò)在昆蟲(chóng)細(xì)胞中過(guò)表達(dá)該基因驗(yàn)證了其對(duì)Cry1Ac毒理的影響。本研究證實(shí)了V-ATPase B是Cry1Ac的功能受體，這為進(jìn)一步研究V-ATPase B的Bt作用方式和在抗性機(jī)制中的作用，以及昆蟲(chóng)對(duì)Bt的抗性治理等提供重要線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試?yán)ハx(chóng) 敏感品系（JY）棉鈴蟲(chóng)購(gòu)于河南省濟(jì)源白云實(shí)業(yè)公司，抗性品系（LF60）棉鈴蟲(chóng)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所饋贈(zèng)，該品系對(duì)Cry1Ac的抗性高于1000倍[25]，兩種品系棉鈴蟲(chóng)均在培養(yǎng)箱中使用人工飼料飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為溫度（26±1）℃、相對(duì)濕度（60±10）%、光周期16L∶8D。

1.1.2 細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)基 草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda卵母細(xì)胞系（Sf9）為美國(guó)亞利桑那大學(xué)饋贈(zèng)，培養(yǎng)在（28±1）℃的培養(yǎng)箱中[26]。Sf-900TMⅡ SFM培養(yǎng)基，含10%熱激失活牛血清、50 U/mL青霉素和50 μg/mL鏈霉素，購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.1.3 試劑與儀器 Cry1Ac原毒素與活化毒素均購(gòu)于北京綻諾思特生物科技有限公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript?RT SuperMix for qPCRⅢ（+gDNA wiper）、DNA聚合酶（2×Taq Master Mix）、PCR產(chǎn)物回收試劑盒（FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit）、熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒（ChamQTM Universal SYBR?qPCR Master Mix）、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒，購(gòu)于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；大腸桿菌Escherichia coli感受態(tài)細(xì)胞DH5α，購(gòu)于北京擎科生物有限公司；大腸桿菌Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)于北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司；氨芐青霉素、臺(tái)盼藍(lán)染色液、20×PBS緩沖液、高效RIPA裂解液（含一支PMSF）、PAGE膠蛋白微量回收試劑盒、牛血清白蛋白V（BSA）、5×蛋白上樣緩沖液，購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、SacⅠ、BagⅡ酶，購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；超敏型ECL發(fā)光液，購(gòu)于亞科因（武漢）生物技術(shù)有限公司；蛋白電泳凝膠制備試劑盒，購(gòu)于陜西中暉赫彩生物醫(yī)藥科技有限公司；轉(zhuǎn)染試劑，購(gòu)于普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；鼠抗His-Tag單克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，購(gòu)于亞科因（武漢）生物技術(shù)有限公司；His標(biāo)簽的pIEx-RFP載體由山東大學(xué)饋贈(zèng)；增強(qiáng)綠色熒光蛋白EGFP，其序列參考[27]方法設(shè)計(jì)合成并由本實(shí)驗(yàn)室保存；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。NANODROP 1000全波長(zhǎng)微量掃描分光光度計(jì)，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司生產(chǎn)；Tanon 4600化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司生產(chǎn)；DYY-3C電泳儀，北京六一儀器廠生產(chǎn)；SHP-250生化培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)；Mastercycle Pro S型PCR儀，Centrifuge5417R型臺(tái)式離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)；ABI 7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)ABI公司生產(chǎn)。

1.2 樣品制備和cDNA合成

分別選取齡期及大小一致的敏感與抗性棉鈴蟲(chóng)，收集3～5齡幼蟲(chóng)各5～10頭，比較其不同發(fā)育時(shí)期不同品系中腸V-ATPase B的表達(dá)量。選取大小一致的4齡末期棉鈴蟲(chóng)，獨(dú)立置于24孔養(yǎng)蟲(chóng)盒中饑餓處理12 h后，飼喂含50 mmol/L Na2CO3緩沖液的人工飼料[27]作為對(duì)照組，同時(shí)飼喂含25 μg/mL Cry1Ac原毒素（LC30）[26]的人工飼料，在樣品取食3、6、12、24和36 h時(shí)，每個(gè)重復(fù)取4～5頭樣品，解剖取其中腸，共3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，Cry1Ac誘導(dǎo)后，比較不同時(shí)間點(diǎn)V-ATPase B基因的表達(dá)量。

利用RNA提取試劑盒在冰上分別提取各處理樣品總RNA，使用DEPC水調(diào)整濃度并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA模板用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 載體構(gòu)建

以棉鈴蟲(chóng)cDNA為模板，利用特異性引物V-ATPase B-CDS-F/R（表1）對(duì)V-ATPase B基因編碼區(qū)（sequence coding for aminoacids in protein，CDS）（登錄號(hào)：XM_021331943.1）擴(kuò)增，本試驗(yàn)中所有引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。50 μL PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件參考[27]。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)5 μL PCR產(chǎn)物，純化產(chǎn)物并將片段連接至克隆載體。用熱激法將5 μL重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐青霉素的抗性篩選，獲得陽(yáng)性重組子并進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。PCR擴(kuò)增條件參考[27]。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)5 μL產(chǎn)物后，將陽(yáng)性克隆菌液注入5 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)14 h，提取質(zhì)粒并由北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

以克隆載體為模板，利用兩對(duì)特異性引物 V-ATPase B-SacⅠ和 V-ATPase B-BagⅡ；V-ATPase BEcoRⅠ和V-ATPase B-XhoⅠ對(duì)V-ATPase B基因編碼區(qū)擴(kuò)增，50 μL PCR反應(yīng)體系與擴(kuò)增條件參考文獻(xiàn)[27]。用5×Loading Buffer和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)5 μL PCR產(chǎn)物，純化產(chǎn)物并將片段分別連接至表達(dá)載體pIEx-RFP與pGEX-6P-1。用熱激法將5 μL重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)入50 μL DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐青霉素的抗性篩選，獲得陽(yáng)性重組子并進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。PCR擴(kuò)增條件同上。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)5 μL產(chǎn)物后，將陽(yáng)性克隆菌液注入5 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，提取質(zhì)粒并由北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.4 熒光定量RT-PCR反應(yīng)

用特異性引物q-V-ATPase B-F/R對(duì)不同品系、不同齡期、不同處理后組織的V-ATP-B基因表達(dá)量檢測(cè)，以EF-1α（U20129.1）和β-actin（HM629442.1）為內(nèi)參基因設(shè)計(jì)內(nèi)參引物 EF-1α-F/R和β-Actin-F/R（表1）。20 μL PCR反應(yīng)體系與程序參考文獻(xiàn)[27]。每組處理有3組生物學(xué)重復(fù)，每組生物學(xué)重復(fù)設(shè)置3組技術(shù)重復(fù)。用擴(kuò)增效率和循環(huán)數(shù)的平均數(shù)計(jì)算所有基因的表達(dá)水平，采用2―△△Ct方法分析試驗(yàn)結(jié)果[28]。

表1 本研究所用引物信息Table 1 List of primers in this study

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和毒理測(cè)定

Sf9細(xì)胞系使用Sf-900TMⅡ SFM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞并在轉(zhuǎn)入24 h后觀察轉(zhuǎn)入pIEx-RFP和V-ATPase B-pIEx-RFP細(xì)胞并拍照[27]。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞并用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，使用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔接種100 μL（含1×104個(gè)細(xì)胞），置于（28±1）℃培養(yǎng)箱中貼壁生長(zhǎng)2 h；在倒置顯微鏡200倍視野下，每孔選擇兩個(gè)獨(dú)立視野，記錄Cry1Ac活化毒素處理前的細(xì)胞存活數(shù)量。去除含抗生素和血清的培養(yǎng)基，加入100 μL含有200 μg/mL Cry1Ac活化毒素且無(wú)血清及抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基，置于（28±1）℃培養(yǎng)箱中處理5 h；記錄存活細(xì)胞數(shù)[27]，收集剩余細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。每次毒理測(cè)定重復(fù)3次，每組獨(dú)立重復(fù)轉(zhuǎn)染3次。死亡率的計(jì)算采用Abbott公式，死亡率＝（處理前細(xì)胞數(shù)目―處理后細(xì)胞數(shù)目）/處理前細(xì)胞數(shù)目×100%[29]。

1.6 V-ATPase B蛋白的提取與Western-blot鑒定

將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞收集并500 g/min離心3 min，用1 mL 1×PBS緩沖液清洗沉淀兩次，再次離心保留沉淀，加入高效RIPA裂解液100 μL、終濃度為1 mmol/L PMSF、5×蛋白上樣緩沖液25 μL并混勻，沸煮5 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)蛋白電泳凝膠制備試劑盒說(shuō)明書(shū)配置SDS-PAGE膠，并通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。將目的蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉4 ℃封閉過(guò)夜；加入1∶2000稀釋的His標(biāo)簽小鼠單克隆抗體（一抗），室溫孵育1 h；1×PBST緩沖液洗脫5次，加入1∶10000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體（二抗），室溫孵育1 h；1×PBST緩沖液洗脫5次，使用化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)儀器拍照。

1.7 V-ATPase B蛋白的誘導(dǎo)、純化與Ligand-blot驗(yàn)證結(jié)合

將V-ATPase B-pGEX-6P-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株Rosetta（DE3）。通過(guò)氨芐青霉素篩選后，挑取單菌落，用含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD600約為0.6時(shí)，取1 mL菌液加入終濃度30%的甘油保存，取400 μL誘導(dǎo)前菌液于4 ℃冰箱保存，剩余菌液加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，37 ℃，180 r/min誘導(dǎo)4 h。取400 μL誘導(dǎo)后菌液，與誘前菌液6000 r/min離心3 min，棄上清用100 μL 1×PBS重懸，加入25 μL蛋白上樣緩沖液，沸煮5 min后于冰上備用。

根據(jù)蛋白電泳凝膠制備試劑盒說(shuō)明書(shū)配置 SDS-Page膠，并通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。蛋白膠脫色后，使用膠回收試劑盒，回收純化蛋白，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

用純化后的蛋白加入終體積0.25倍的蛋白上樣緩沖液，沸煮5 min，同上配置SDS-Page膠，并通過(guò)凝膠電泳展現(xiàn)目的蛋白。將目的蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉4 ℃封閉過(guò)夜；加入終濃度2 μg/mL Cry1Ac活化毒素，孵育2 h，1×PBST緩沖液洗脫5次，加入1∶10000稀釋的Cry1A抗體（一抗），室溫孵育1 h；1×PBST緩沖液洗脫5次，加入1∶10000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（二抗），室溫孵育1 h；1×PBST緩沖液洗脫5次，使用化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)儀器拍照。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)使用Excel 2019軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同處理間的比較采用單因素方差分析，采用t檢驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 V-ATPase B基因在Cry1Ac抗感棉鈴蟲(chóng)品系中的表達(dá)差異

熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，V-ATPase B基因在3、4、5齡棉鈴蟲(chóng)各齡期中腸均有表達(dá)，并且其在敏感品系JY的表達(dá)量均顯著高于同齡期抗性品系LF60中的表達(dá)量（3齡中P＝0.00001，4齡中P＝0.02045，5齡中P＝0.00531，圖1）。

圖1 V-ATPase B基因在抗感Cry1Ac棉鈴蟲(chóng)中表達(dá)差異Fig.1 The expression level of V-ATPase B in Cry1Ac-susceptible and -resistance Helicoverpa amigera

2.2 V-ATPase B基因響應(yīng)Cry1Ac刺激下調(diào)表達(dá)

棉鈴蟲(chóng)5齡幼蟲(chóng)取食含有亞致死劑量25 μg/mL的Cry1Ac原毒素后，中腸組織中V-ATPase B基因表達(dá)量顯著降低。從取食3 h后一直到36 h，棉鈴蟲(chóng)中腸中V-ATPase B表達(dá)量持續(xù)顯著下降（3 h時(shí)P＝0.00480，6 h時(shí)P＝0.00002，12 h時(shí)P＝0.00013，24 h時(shí)P＝0.00003，36 h時(shí)P＝0.00001，圖2）。

圖2 5齡棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)取食Cry1Ac后的V-ATPase B基因表達(dá)量Fig.2 The expression level of V-ATPase B of the 5th-instar Helicoverpa amigera larvae fed with Cry1Ac

2.3 Ligand blot驗(yàn)證V-ATPase B與Cry1Ac結(jié)合

通過(guò)原核表達(dá)V-ATPase B蛋白，經(jīng)SDS-PAGE梯度膠電泳檢測(cè)，V-ATPase B蛋白在80.8 kDa處表達(dá)（基因54.9 kDa＋標(biāo)簽蛋白25.9 kDa），結(jié)果表明V-ATPase B被成功誘導(dǎo)表達(dá)（圖3A）。進(jìn)一步地對(duì)原核表達(dá)的V-ATPase B蛋白進(jìn)行純化，基本得到一條明顯單一的V-ATPase B蛋白（圖3B）。然后通過(guò)Ligand blot試驗(yàn)證實(shí)顯示V-ATPase B可以與Cry1Ac活化毒素特異結(jié)合（圖3C）。說(shuō)明V-ATPase B可能為Cry1Ac活化毒素受體結(jié)合蛋白。

圖3 V-ATPase B蛋白的表達(dá)純化及與Cry1Ac的結(jié)合特性Fig.3 Expression and purification of V-ATPase B protein and its binding properties with Cry1Ac

2.4 V-ATPase B的亞細(xì)胞定位

將V-ATPase B-pIEx-RFP和pIEx-RFP質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察到紅色熒光，說(shuō)明相應(yīng)蛋白已成功表達(dá)于細(xì)胞中，V-ATPase B蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞核中沒(méi)有表達(dá)（圖4）。

圖4 V-ATPase B在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和定位Fig.4 The expressions and localization of V-ATPase B in cells

2.5 表達(dá)V-ATPase B蛋白增強(qiáng)了Cry1Ac的細(xì)胞毒力

在觀察到V-ATPase B蛋白的表達(dá)后，進(jìn)一步通過(guò)Western blot確定了V-ATPase B蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)（圖5A）。隨后，用終濃度為 200 μg/mL Cry1Ac活化毒素處理細(xì)胞，Sf9細(xì)胞的死亡率顯著提高（P＝0.03233，圖5B）。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)V-ATPase B可以增加細(xì)胞對(duì)Cry1Ac的敏感性。

圖5 表達(dá)V-ATPase B對(duì)Sf9細(xì)胞毒性的影響Fig.5 Effects of overexpression of V-ATPase B on the cytotoxicity in Sf9 cells

3 討論

本研究中我們發(fā)現(xiàn)V-ATPase B基因在Cry1Ac抗性品系中低表達(dá)（圖1），盡管本研究中是用LF60的抗性品系跟濟(jì)源購(gòu)買的敏感品系（據(jù)了解近些年采于田間）相比的，但是V-ATPase B基因在室內(nèi)篩選的BtR抗性品系中也顯著降低表達(dá)[24]，這進(jìn)一步說(shuō)明了V-ATPase B基因在抗性品系中低表達(dá)是普遍存在的。此外在受到Cry1Ac誘導(dǎo)時(shí)，V-ATPase B基因也下調(diào)表達(dá)，這跟很多V-ATPase B基因在受到Bt誘導(dǎo)時(shí)低表達(dá)的結(jié)果一致[30-32]。因此V-ATPase B基因可能作為功能受體參與棉鈴蟲(chóng)對(duì)Cry1Ac的抗性，機(jī)體通過(guò)降低V-ATPase B基因的表達(dá)來(lái)減少Cry1Ac對(duì)昆蟲(chóng)的傷害。

V-ATPase B作為Bt的結(jié)合蛋白已經(jīng)被廣泛報(bào)道，例如Qiu等[16]報(bào)道甜菜夜蛾Spodoptera exigua的V-ATPase B可以與Cry2Aa結(jié)合；Xie等[33]報(bào)道小菜蛾P(guān)lutella xylostella的V-ATPase B和Cry1Ac具有結(jié)合特性。鄒朗云等[24]也通過(guò)Ligand blot證實(shí)棉鈴蟲(chóng)的V-ATPase B可以與Cry1Ac、Cry2Ab和Cry1C結(jié)合。我們通過(guò)構(gòu)建棉鈴蟲(chóng)的中腸酵母文庫(kù)篩選Cry1Ac的結(jié)合蛋白，也篩選到了結(jié)合蛋白V-ATPase B（未發(fā)表數(shù)據(jù)），在本研究中也進(jìn)一步地通過(guò)Ligand blot證實(shí)棉鈴蟲(chóng)V-ATPase B可以與Cry1Ac結(jié)合（圖3）。上述研究多方證實(shí)了V-ATPase B是Cry1Ac的結(jié)合蛋白。然而，我們對(duì)V-ATPase B的亞細(xì)胞定位研究表明其主要分布在細(xì)胞質(zhì)中（圖4），這與其他研究報(bào)道V-ATPase B基因主要存在于細(xì)胞內(nèi)許多細(xì)胞器的膜中的結(jié)果一致[18]。但是已報(bào)道的Bt蛋白的受體多位于細(xì)胞膜上，我們分析盡管V-ATPase B在胞內(nèi)分布卻能與Bt蛋白結(jié)合的原因，可能與之前我們推測(cè)的ATPs-α與Cry2Ab蛋白互作的方式一樣[27]。一方面據(jù)報(bào)道Cry1Ac的部分結(jié)構(gòu)可以插入膜內(nèi)[35]，這些結(jié)構(gòu)可能與膜內(nèi)的受體，如V-ATPase B結(jié)合。此外，整個(gè)活化的Cry蛋白可以透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[36,37]，進(jìn)而與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分布的V-ATPase B結(jié)合?？傊?，綜合文獻(xiàn)和我們的研究結(jié)果表明棉鈴蟲(chóng)V-ATPase B是Cry1Ac的一個(gè)結(jié)合蛋白。

V-ATPase B蛋白不但是Bt殺蟲(chóng)蛋白的結(jié)合蛋白，它也參與Bt的毒力過(guò)程。Qiu等[16]報(bào)道了甜菜夜蛾的V-ATPase B不僅與Cry2Aa結(jié)合，而且通過(guò)RNAi干擾V-ATPase B能顯著降低甜菜夜蛾對(duì)Cry2Aa的敏感度。此外，敲除二化螟Chilo suppressalis幼蟲(chóng)的V-ATPase A基因?qū)е露紫x(chóng)對(duì)表達(dá)Cry2Aa和Cry1Ca水稻的敏感性顯著降低[38]。本研究中，我們通過(guò)在昆蟲(chóng)細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)棉鈴蟲(chóng)V-ATPase B基因，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)Cry1Ac的敏感度增強(qiáng)（圖5），這一結(jié)果證實(shí)棉鈴蟲(chóng)V-ATPase B參與了Cry1Ac的毒力過(guò)程。這是我們首次報(bào)道V-ATPase B在Cry1Ac毒力過(guò)程的功能。由于V-ATPase B基因在抗性品系中低表達(dá)，同時(shí)V-ATPase B蛋白與Cry1Ac結(jié)合，我們推測(cè)棉鈴蟲(chóng)V-ATPase B是Cry1Ac的功能受體。但是關(guān)于V-ATPase B在棉鈴蟲(chóng)對(duì)Cry1Ac的抗性機(jī)制中的作用和貢獻(xiàn)還有待進(jìn)一步的研究。