石 穎 陳子揚 陳凱銘 胡艷紅 胡 俊 陳 勝

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是由于糖尿病(DM)患者體內(nèi)長期處于高血糖狀態(tài)導(dǎo)致的糖脂代謝紊亂引發(fā)的慢性炎癥，損害視網(wǎng)膜微血管細胞，引起微血管的擴張、滲漏、閉塞，繼而出現(xiàn)視網(wǎng)膜無灌注區(qū)，使視網(wǎng)膜缺血、缺氧，最終發(fā)展成增生型DR[1]。相關(guān)研究表明，中國有超過40%的DM患者會出現(xiàn)DR[1]。在一項納入了北美洲、大洋洲、 歐洲和亞洲人群的薈萃分析結(jié)果表明，DR的總發(fā)病率達34.6%，近20年全世界范圍內(nèi)DR導(dǎo)致失明人群增加了27%，DR 相關(guān)的視力障礙增加了64%[2-3]?？梢奃R發(fā)病率仍處于居高不下的狀態(tài)，防治DR仍是眼科防盲的重點。

微小RNA(miRNA)表達和視網(wǎng)膜細胞自噬狀態(tài)的異常與DR的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，增生型DR患者的外周血血漿中miR-21的表達水平明顯高于非增生型DR患者[4]。此外，在DR患者視網(wǎng)膜中，異常的自噬參與了視網(wǎng)膜神經(jīng)變性、炎癥、氧化應(yīng)激、凋亡等病理改變；在DR模型中，人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞(HRCECs)存在異常的自噬，可進一步導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞遷移增強，并促進新生血管形成[5-6]。有證據(jù)表明，在缺血、缺氧、高糖細胞模型中已發(fā)現(xiàn)miR-21可以影響細胞的自噬[7-9]。但此調(diào)控機制在高糖環(huán)境下HRCECs中的作用仍有待進一步證實。

DR屬于中醫(yī)學(xué)的消渴內(nèi)障范疇，本課題組臨床長期應(yīng)用補陽還五湯(清·王清任·《醫(yī)林改錯》)加減治療DR，發(fā)現(xiàn)其具有增效作用[10]。但其具體的作用機制是否與影響高糖下HRCECs的自噬和miR-21表達有關(guān)尚未明確。因此，本研究擬觀察補陽還五湯對高糖培養(yǎng)下的HRCECs 的miR-21表達的影響，并探討補陽還五湯對miR-21介導(dǎo)的自噬的影響，以期為DR自噬調(diào)控機制及藥物治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞HRCECs(購自深圳豪地華拓生物科技有限公司)，用含有體積分數(shù)10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、含體積分數(shù)5%CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d換液1次。待細胞長至約80%融合時,用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化傳代。取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2 藥品補陽還五湯的中藥組成為黃芪125 g、當歸6 g、赤芍5 g及地龍、川芎、桃仁、紅花各3 g[11]，以上中藥均來自福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院中藥房。將以上生藥水煎煮并濃縮成濃度1000 g·L-1藥液，滅菌注射用水稀釋成5 g·L-1，冷卻到常溫后，用0.22 μm直徑針頭式過濾器過濾備用。

1.3 主要試劑與儀器低糖培養(yǎng)基、2.5 g·L-1胰蛋白酶溶液(美國Gibco公司)，體積分數(shù)5%葡萄糖(湖南科倫制藥有限公司)，DMEM/F-12(北京Solarbio公司)，優(yōu)質(zhì)胎牛血清(德國PAN biotech公司)，PBS(美國Hyclone公司)，Lipofectamine3000試劑盒(美國Invitrogen 公司)，Trizol試劑盒、Promega試劑盒、Takara SYBR Green熒光定量試劑盒(美國Santa Cruz公司)。RIPA細胞裂解液和蛋白定量試劑盒(上海碧云天有限公司)。兔抗人LC3多克隆抗體、過氧化物酶標記羊抗兔IgG、GAPDH(美國Proteintech公司)。Multiskan FC型酶標儀 (美國Thermo Fisher Scientific公司)；IX71型倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；7500 Fast型實時熒光定量PCR(qRT-PCR)系統(tǒng)(美國Applied Biosystems公司) 。

1.4 miR-21 mimic轉(zhuǎn)染取對數(shù)生長期HRCECs，按1×105個·mL-1接種于6孔培養(yǎng)板，細胞長至約80%融合時，按Lipofectamine3000試劑盒說明書操作轉(zhuǎn)染，配制轉(zhuǎn)染液：A液為25 μL opti-MEM加入7.5 μL Lipofectamine 3000；B液為25 μL opti-EME加入10 μL miR-21 mimic(20 μmol·L-1)。A液與B液混勻并避光靜置5 min，將A、B混合液滴加至細胞培養(yǎng)板中，于細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)6 h后更換為完全培養(yǎng)基，熒光顯微鏡下觀察、拍照并計算熒光強度。

1.5 細胞分組及給藥處理根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果用含25.0 g·L-1葡萄糖的培養(yǎng)基孵育HRCECs作為高糖損傷模型，5 g·L-1的補陽還五湯水提液干預(yù)24 h用于探討補陽還五湯水提液對高糖下培養(yǎng)的HRCECs的保護作用。實驗分為5組，其中，正常對照組：用含低糖(5.5 g·L-1葡萄糖)的培養(yǎng)基孵育HRCECs；高糖組：用含25.0 g·L-1葡萄糖的培養(yǎng)基孵育HRCECs；補陽還五湯組：用含25.0 g·L-1葡萄糖和5 g·L-1補陽還五湯水提液的培養(yǎng)基孵育HRCECs；miR-21 mimic組：用含25.0 g·L-1葡萄糖的培養(yǎng)基孵育轉(zhuǎn)染miR-21 mimic的HRCECs；miR-21 mimic+補陽還五湯組：用含25.0 g·L-1葡萄糖和5 g·L-1補陽還五湯水提液的培養(yǎng)基孵育轉(zhuǎn)染 miR-21 mimic的 HRCECs。各組細胞均孵育24 h后用于后續(xù)實驗。

1.6 qRT-PCR法檢測miR-21表達將HRCECs按每孔1×105個接種到6孔培養(yǎng)板中，分組處理24 h后，去除培養(yǎng)基，加入1 mL Trizol提取液提取細胞總RNA。莖環(huán)法反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，取1 μL cDNA樣品用于miR-21檢測。引物設(shè)計與合成由上海博尚生物技術(shù)有限公司完成，引物序列：Hsa-miR-21正向引物為5’-CCGCGCCTAGCTTATCAGACTGA-3’，反向引物為5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’；莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物為5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAACA-3’；內(nèi)參基因U6正向引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’，反向引物為5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’。整個擴增反應(yīng)體系參照試劑盒說明書進行，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，70 ℃ 10 s，40個循環(huán)。采用公式2-ΔΔCt計算miR-21的相對表達量。

1.7 Western blot檢測細胞中LC3蛋白表達將HRCECs按每孔1×105個接種到6孔培養(yǎng)板中，分組處理24 h后，去除培養(yǎng)基，用細胞裂解液RIPA裂解細胞。收集細胞裂解液，用蛋白定量試劑盒檢測LC3蛋白的含量。上樣20 μg蛋白進行SDS-page電泳和PVDF轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜進行封閉，室溫孵育30 min，加兔抗人LC3多克隆抗體(110 000) 或GAPDH(110 000)4 ℃孵育過夜；TBST漂洗3次(每次10 min)后加入過氧化物酶標記羊抗兔IgG(120 000)室溫孵育1 h；TBST漂洗3次(每次10 min)后進行化學(xué)發(fā)光顯色。用化學(xué)發(fā)光成像儀檢測LC3蛋白表達。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 miR-21 mimic轉(zhuǎn)染情況熒光顯微鏡下可見，轉(zhuǎn)染miR-21 mimic后，HRCECs的細胞形態(tài)完整，呈纖維狀，大部分細胞呈綠色熒光(圖1)，熒光強度為32.708±1.001。

圖1 轉(zhuǎn)染 miR-21 mimic后的HRCECs(×100)

2.2 補陽還五湯對高糖培養(yǎng)的HRCECs的miR-21表達的影響qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，正常對照組、高糖組、補陽還五湯組、miR-21 mimic組miR-21相對表達量分別為0.993±0.015、5.892±0.341、1.264±0.063和106.677±5.787。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，與正常對照組相比，高糖組HRCECs中miR-21相對表達量明顯升高(P<0.001)；與高糖組相比，miR-21 mimic組miR-21相對表達量明顯升高(P<0.01),補陽還五湯組 miR-21相對表達量明顯下降(P<0.001)；補陽還五湯組與正常對照組HRCECs中miR-21相對表達量相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.296)。提示補陽還五湯可以抑制高糖誘導(dǎo)的HRCECs中miR-21表達增高。

2.3 miR-21在補陽還五湯抑制高糖培養(yǎng)下的HRCECs自噬中的作用各組HRCECs中LC3蛋白表達見圖2。與正常對照組比較，高糖組和miR-21 mimic組HRCECs中LC3蛋白相對表達量均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)，且miR-21 mimic組HRCECs中LC3蛋白相對表達量高于高糖組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)。補陽還五湯組HRCECs中LC3蛋白相對表達量低于高糖組和miR-21 mimic組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)，與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.197)。miR-21 mimic+補陽還五湯組HRCECs中LC3蛋白相對表達量低于miR-21 mimic組，但高于補陽還五湯組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)，與高糖組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.930)(圖2)。

圖2 Western blot檢測各組HRCECs中LC3蛋白表達 與正常對照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，▲P<0.05；與miR-21 mimic組比較，#P<0.05；與補陽還五湯組比較，△P<0.05。

3 討論

隨著DR發(fā)病率的逐年上升，尋求有效控制DR病程及減少并發(fā)癥的治療方法迫在眉睫。miRNA在DR的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-21不僅在DR患者血清中表達上調(diào)，而且在增生型DR患者的血清中miR-21表達水平較非增生型DR患者中的表達水平明顯上調(diào)[12]。血漿miR-21可通過負向調(diào)控染色體上的磷酸酶張力蛋白同源性缺失導(dǎo)致下游的血管內(nèi)皮生長因子表達量增高，進而促進新生血管生成，推進了DR的發(fā)展速度[13-14]。國外有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在DR大鼠模型中血管內(nèi)皮細胞的miR-21表達顯著高于對照組，miR-21可進一步激活炎癥介質(zhì)通路，促進血管炎癥的發(fā)生,亦可通過誘導(dǎo)細胞分化和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)參與DR的進展[15-17]。本研究通過細胞實驗發(fā)現(xiàn)了高糖環(huán)境下HRCECs的miR-21表達較正常對照組明顯增高，同樣證實了miR-21參與微血管內(nèi)皮細胞的高糖損傷過程。

自噬是細胞在生理或病理因子作用下，通過溶酶體途徑對錯誤折疊的蛋白質(zhì)和功能受損的細胞器進行有效識別和降解的過程[18]。因此，自噬被認為是細胞除凋亡和壞死之外的第三種死亡方式。研究發(fā)現(xiàn)，在高糖環(huán)境下，色素上皮細胞、視網(wǎng)膜 Müller 細胞、血管內(nèi)皮細胞均發(fā)生自噬[19]。高糖可以激活視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞自噬，最終通過影響細胞的增殖、分化，進而提升細胞遷移和管腔形成能力，發(fā)揮促進血管生成的作用[20-21]。LC3 是自噬活化過程的關(guān)鍵蛋白，是觀察自噬現(xiàn)象是否存在、研究自噬活性較為可靠的生物學(xué)標志物[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下的HRCECs 的LC3蛋白表達較正常對照組升高，與文獻報道[20-21]結(jié)果相似。此外有研究表明，miRNA參與調(diào)控細胞的自噬，如miR-21可以影響高糖損傷的足細胞模型的自噬[9]。為明確高糖下miR-21對HRCECs自噬的影響，本研究檢測了LC3蛋白的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染了miR-21 mimic的HRCECs中，LC3蛋白的表達量進一步增高，說明HRCECs中miR-21的表達對細胞自噬有一定的影響。

DR為中醫(yī)“消渴內(nèi)障病”，其病位在瞳神。祖國醫(yī)學(xué)認為，DR的發(fā)展經(jīng)歷了由氣陰兩虛至肝腎虧虛再至陰陽兩虛的轉(zhuǎn)化特點，虛、痰、瘀是發(fā)病過程中3個重要致病因素[24]；且在非增生期的早期表現(xiàn)以“虛”為主，至中后期表現(xiàn)以“瘀”為主，最終發(fā)展為增生型DR，出現(xiàn)新生血管是痰瘀互結(jié)的病理產(chǎn)物[25]。有學(xué)者認為，DR以“氣虛”為本，“血瘀”貫穿DR發(fā)病的始終，不同發(fā)病階段病機有所差異，但“氣虛血瘀”貫穿整個疾病的始終，這為益氣活血法治療消渴奠定了理論基礎(chǔ)[26-28]。補陽還五湯具有補氣活血通絡(luò)之功效，雖然是治療中風(fēng)的名方，但目前已被臨床廣泛應(yīng)用于治療各科疾病，其在治療糖尿病及其諸多并發(fā)癥中具有顯著的療效，能促進內(nèi)皮祖細胞修復(fù)損傷的血管內(nèi)皮[29]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯加減方在治療DR及其相關(guān)并發(fā)癥中有著增效作用[10]，但其機制尚未明了，本研究在前期已經(jīng)證明的補陽還五湯減輕高糖環(huán)境下HRCECs自噬的基礎(chǔ)上，進一步探討了miR-21的作用。結(jié)果表明，補陽還五湯可以下調(diào)高糖環(huán)境下HRCECs的miR-21表達，并降低高糖環(huán)境下轉(zhuǎn)染miR-21 mimic的HRCECs的LC3蛋白表達。說明補陽還五湯下調(diào)miR-21和LC3表達的作用相互影響。

綜上所述，高糖環(huán)境中，miR-21介導(dǎo)了HRCECs的自噬，補陽還五湯可以下調(diào)HRCECs的miR-21表達，進而減少細胞自噬，對高糖導(dǎo)致的HRCECs損傷起到保護作用。