張兵 王孝玉 朱亞輝 張仕慧 胡凌云

(南充市中心醫(yī)院 1.骨科；2.醫(yī)學(xué)影像科，四川 南充 637000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rrheumatoidarthritis, RA)屬于全身性免疫性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要特征，目前其病因和發(fā)病機制尚不清楚[1-2]。正常的滑膜組織是由結(jié)締組織以及滑膜襯里層組成，襯里層包括滑膜成纖維細胞(Fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)，對維持關(guān)節(jié)腔具有穩(wěn)定的作用，參與RA病理變化[3-4]。研究顯示，RA與基因表達有關(guān)，基因調(diào)控FLS細胞的增殖和凋亡，分子靶向治療可能是RA潛在的治療方式[5]。miRNA沒有編碼蛋白質(zhì)的能力，其長度一般在20 nt左右，miRNA與細胞生長、細胞凋亡、能量代謝、氧化應(yīng)激等有關(guān)[6-8]。miRNA還與人類疾病如腫瘤、糖尿病等疾病的進展有關(guān)，對分子靶向治療的具有重要作用[9-10]。研究顯示miR-21具有調(diào)控胚胎發(fā)育、器官形成、腫瘤、哮喘、成骨分化等的進展有關(guān)[11-13]。有研究顯示，上調(diào)miR-21表達減輕RA大鼠模型關(guān)節(jié)炎指數(shù)，改善RA癥狀[14]。RA患者中miR-21表達量降低，抑制miR-21能夠促進RA-FLS釋放炎癥因子，以及改善RA患者Th17/Treg細胞失衡[15-16]。這些研究均證明了miR-21參與RA進展。目前尚不明確miR-21在RA-FLS增殖和凋亡中的作用。本次實驗體外分離培養(yǎng)RA-FLS，探討miR-21對RA-FLS增殖、凋亡的影響和可能機制，為基因靶向治療RA提供可能思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 RA患者以及健康對照(關(guān)節(jié)外傷)滑膜組織均采集自2018年7月～2020年2月南充市中心醫(yī)院；蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)抗體購自美國Invitrogen公司；miR-X miRNA First-Strand Synthesis kit購自丹麥Exiqon公司；B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)抗體購自上海晅科生物科技有限公司；p-PI3K抗體購自上海鑫樂生物科技有限公司；RNAiso for Small RNA購自寶生物工程(大連)有限公司；Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein, Bax)抗體、p-Akt抗體購自美國santacruze公司；mimics control、miR-21 mimics由Thermo Fisher Scientific公司構(gòu)建；C-Caspase-3抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；磷脂酰肌醇-3激酶(Phospoinositide 3-kinase，PI3K)抗體購自美國Abcam公司。本研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過。

1.2 方法

1.2.1 FLS分離培養(yǎng)[13]RA滑膜組織和健康滑膜組織均浸泡在含有10%雙抗的PBS溶液內(nèi)，將表面的脂肪等組織去除，再次用PBS洗滌2次。用剪刀和鑷子把組織剪碎，大小約為1 mm3，置于培養(yǎng)瓶內(nèi)，添加適量的0.4%的Ⅰ型膠原酶消化，期間每間隔30 min將細胞瓶翻轉(zhuǎn)，2 h后，將細胞培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，以吸管將細胞沉淀混勻，1000 g離心10 min。添加含有EDTA-0.25%胰蛋白酶的消化液孵育30 min，期間每隔10 min搖晃1次。添加DMEM，過濾(200目)，1000 g離心10 min，棄掉上清溶液，添加培養(yǎng)液(10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM)懸浮，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。48 h后，更換新鮮的細胞培養(yǎng)液，將懸浮的細胞棄掉，繼續(xù)培養(yǎng)，期間每隔2 d換液1次，培養(yǎng)至第3代，經(jīng)細胞免疫化學(xué)法鑒定為FLS(Vimentin表達陽性，CD68表達陰性)。

1.2.2 Realtime PCR方法檢測miR-21表達 取第4代RA-FLS和正常-FLS，添加RNAiso for Small RNA試劑，常規(guī)方法提取miRNA，將miRNA溶解在DEPC水中，放在-80℃保存。利用miR-X miRNA First-Strand Synthesis kit進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，取0.5 μg的miRNA樣品，添加5 μL的mRQ Buffer、1.25 μL的mRQ Enzyme，充分混合后，放在37℃孵育1 h，然后放在85℃孵育5 min，合成的cDNA放在-20℃保存。PCR擴增反應(yīng)如下：2 μL的cDNA、0.5 μL的mRQ 3＇primer、0.5 μL的miRNA-specific primer、0.5 μL的ROX Dye、12.5 μL的SYBR advantage premix，最后添加ddH2O至25 μL，設(shè)置反應(yīng)條件如下：95℃ 10 s，95℃ 5 s，60℃ 20 s，72℃ 30 s。U6作為內(nèi)參，按照2-△△Ct法計算miR-21的表達變化。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染和分組 RA-FLS接種到6孔板內(nèi)，分別把mimics control、miR-21 mimics轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染步驟按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000說明書進行。將轉(zhuǎn)染mimics control、miR-21 mimics以后的RA-FLS設(shè)置為miR-NC組、miR-21組，Control組為沒有轉(zhuǎn)染的RA-FLS。Control組、miR-NC組、miR-21組細胞培養(yǎng)48 h以后，按照1.2.2中方法檢測miR-21的表達差異。

1.2.4 CCK-8實驗測定細胞增殖活性變化 RA-FLS配制成5×104個細胞/mL，分別吸取100 μL的細胞懸浮液添加到96孔板內(nèi)，在37℃過夜，按照Control組、miR-NC組、miR-21組方法分組處理，細胞培養(yǎng)48 h后，分別在細胞中添加10 μL 的CCK-8溶液，繼續(xù)放在37℃孵育1 h，檢測450 nm的A值。A值表示細胞增殖活性大小。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡變化 Control組、miR-NC組、miR-21組細胞培養(yǎng)48 h后，收集細胞，分別用PBS將細胞洗滌3次，最后將細胞懸浮在400 μL的結(jié)合緩沖液中，添加5 μL的Annexin V-FITC溶液，放在室溫孵育20 min，繼續(xù)添加5 μL的PI溶液，放在室溫孵育20 min，立即用流式細胞儀檢測細胞凋亡變化。

1.2.6 Western blot方法檢測細胞中C-Caspase-3、Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達變化 Control組、miR-NC組、miR-21組細胞培養(yǎng)48 h后，分別在細胞中添加細胞裂解溶液(PMSF∶RIPA=1∶100)，放在冰上孵育30 min，以細胞刮刀將細胞收集，轉(zhuǎn)移到干凈的EP管內(nèi)，4℃，12000 g離心10 min，上清吸取到新的EP管內(nèi)，放在-80℃保存。利用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度。配制10%的分離膠和5%的濃縮膠。將蛋白樣品和等體積的Loading Buffer混合后，在100℃煮沸5 min。把蛋白添加到上樣孔內(nèi)，每個孔中加40 μg的蛋白。首先按照60 V的電壓電泳，等到染料電泳至濃縮膠和分離膠的分層處時，更換成90 V的電壓繼續(xù)電泳，觀察染料到達底部邊緣之后，停止電泳。NC膜根據(jù)凝膠的大小裁剪，然后浸泡在甲醇中濕潤15 s，浸泡至轉(zhuǎn)膜緩沖液中孵育5 min。以常規(guī)方法在4℃進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜電流為300 mA，轉(zhuǎn)膜2 h后，取出NC膜。將NC膜浸泡在5%牛血清白蛋白中，在室溫中孵育1 h。然后將NC膜放在一抗溶液中(C-Caspase-3抗體按照1∶800稀釋，Akt、PI3K、Bax、Bcl-2抗體按照1∶1000稀釋，p-PI3K、p-Akt抗體按照1∶600稀釋)，在4℃結(jié)合過夜。NC膜放在二抗溶液中，在室溫中結(jié)合2 h。以ECL方法顯色。分析條帶的灰度值，根據(jù)灰度值，以GAPDH作為參照，分析蛋白水平。

1.2.7 PI3K/Akt信號激活劑對miR-21影響FLS細胞增殖和凋亡的作用測定 取轉(zhuǎn)染了miR-21 mimics后的RA-FLS，以含有100 ng/mL的PI3K/Akt信號通路特異性激活劑胰島素生長因子-1(Insulin-like growth factor-1,IGF-1)處理，記為miR-21+IGF-1組，以miR-21組為參照，檢測細胞增殖(步驟參照1.2.4中CCK-8)、凋亡(步驟參照1.2.5中流式細胞術(shù))和細胞中C-Caspase-3、Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(步驟參照1.2.6中Western blot)。

2 結(jié)果

2.1 RA-FLS中miR-21表達水平降低 與正常-FLS比較，RA-FLS中miR-21表達水平降低(P<0.05)。提示RA-FLS中miR-21低表達。見表1。

表1 正常-FLS和RA-FLS中miR-21的表達水平比較

2.2 miR-21對RA-FLS增殖和凋亡影響 與Control組、miR-NC組比較，miR-21組RA-FLS細胞中miR-21表達水平升高，細胞增殖活性降低，細胞凋亡率增加，細胞中C-Caspase-3、Bax蛋白表達增多，Bcl-2蛋白表達減少(P<0.05)。提示miR-21降低RA-FLS增殖活性，誘導(dǎo)細胞凋亡。見圖1、表2。

圖1 miR-21 mimics轉(zhuǎn)染后細胞凋亡和細胞中相關(guān)蛋白表達變化

2.3 miR-21對RA-FLS中PI3K/Akt信號通路的作用 與Control組、miR-NC組比較，miR-21組RA-FLS細胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白水平均降低(P<0.05)。提示miR-21降低RA-FLS中PI3K/Akt信號通路激活水平。見圖2、表3。

表2 miR-21 mimics轉(zhuǎn)染后細胞增殖活性、凋亡率和細胞中相關(guān)蛋白水平比較

圖2 上調(diào)miR-21對RA-FLS細胞中PI3K/Akt信號相關(guān)蛋白表達影響

2.4 PI3K/Akt信號通路激活劑對miR-21影響RA-FLS增殖、凋亡的作用 與miR-21組比較，miR-21+

表3 上調(diào)miR-21后RA-FLS細胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白水平比較

IGF-1組RA-FLS增殖活性升高，細胞凋亡率降低，細胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達增多，C-Caspase-3、Bax蛋白表達減少，Bcl-2蛋白表達增多(P<0.05)。提示激活PI3K/Akt信號逆轉(zhuǎn)miR-21對RA-FLS增殖、凋亡作用。見圖3、表4。

圖3 IGF-1對上調(diào)miR-21的RA-FLS細胞凋亡和細胞中相關(guān)蛋白表達影響

表4 表4 IGF-1上調(diào)miR-21后RA-FLS細胞增殖活性、凋亡率和細胞中相關(guān)蛋白水平比較

3 討論

RA發(fā)病率較高，患者的關(guān)節(jié)內(nèi)發(fā)生炎癥后，能誘導(dǎo)軟骨、骨組織損傷，最終誘導(dǎo)關(guān)節(jié)功能障礙，影響RA患者正常行動能力和勞動能力[17-19]。滑膜組織增生是RA發(fā)生的典型特征，雖然炎癥在滑膜襯里層中長期存在，但RA-FLS過度增殖是誘導(dǎo)滑膜增生的關(guān)鍵因素[20-21]。既往研究顯示，miRNA參與RA發(fā)生，能夠影響RA-FLS生物學(xué)行為[22]。Liu等[14]研究顯示，miR-21與RA有關(guān)，過表達miR-21減輕RA大鼠模型關(guān)節(jié)炎癥。Hu等[15]研究結(jié)果顯示，miR-21對RA-FLS釋放炎癥因子的有抑制作用。本次實驗結(jié)果顯示，RA-FLS中miR-21表達水平降低，上調(diào)miR-21可降低RA-FLS細胞增殖活性，提示上調(diào)miR-21抑制RA-FLS增殖，這與以上的研究結(jié)果相符合，表明miR-21在RA進展中可能扮演抑制因子的作用。

RA患者中FLS過度增殖的同時細胞凋亡減少。細胞凋亡是一個復(fù)雜過程，與細胞凋亡有關(guān)調(diào)控因子很多，Caspase-3是Caspase蛋白家族中的凋亡執(zhí)行因子，Caspase-3活化后形成C-Caspase-3被認為是細胞凋亡不可逆的標志[23]。Bcl-2蛋白家族包括促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白，Bax屬于Bcl-2蛋白家族中的促凋亡蛋白，Bcl-2屬于Bcl-2蛋白家族中的抑凋亡蛋白，二者表達改變與細胞凋亡進程有關(guān)[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-21后的RA-FLS中C-Caspase-3、Bax蛋白表達水平均升高，而Bcl-2蛋白水平降低，上調(diào)miR-21誘導(dǎo)RA-FLS凋亡，這與細胞凋亡檢測結(jié)果相一致，miR-21具有誘導(dǎo)RA-FLS凋亡的作用。

信號通路在RA發(fā)生中作用廣泛，PI3K/Akt是在RA中過度激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，降低PI3K/Akt信號激活水平抑制RA-FLS細胞增殖[26]。miRNA不具備編碼蛋白質(zhì)的作用，其可以通過調(diào)控下游信號通路發(fā)揮生物學(xué)作用，并且在不同的病理或生理過程中miRNA的調(diào)控機制有差異[27]。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)miR-21后的RA-FLS中PI3K/Akt信號激活水平降低，且PI3K/Akt信號激活劑可以逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-21抗RA-FLS增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡的作用，這進一步說明了miR-21通過PI3K/Akt信號發(fā)揮作用。

miR-21在RA-FLS中可能發(fā)揮保護作用，miR-21通過降低PI3K/Akt信號激活水平抑制RA-FLS增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，為分子靶向治療RA提供了參考思路。本研究不足之處在于，miR-21通過PI3K/Akt信號對RA具體作用機制還不明確，需要在后續(xù)的實驗中進一步探討。

4 結(jié)論

上調(diào)miR-21可抑制RA-FLS增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，機制可能與降低PI3K/Akt信號激活水平有關(guān)。